Formulering en karakterisering van bioactieve stof die nanoschijven bevat

Ontluikende discoïdale lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL’s) zijn van nature voorkomende voorlopers van het veel overvloedigere bolvormige HDL dat aanwezig is in de menselijke bloedsomloop. Deze ontluikende deeltjes, ook wel pre-ß HDL genoemd, bezitten unieke en onderscheidende structurele eigenschappen¹. Inderdaad, in plaats van te bestaan als een sferoïdaal deeltje, zijn ontluikende HDL’s schijfvormig. Uitgebreide structurele karakteriseringsstudies op natuurlijke en gereconstitueerde discoïdale HDLs hebben aangetoond dat ze bestaan uit een fosfolipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door een amfipathisch uitwisselbaar apolipoproteïne (apo), zoals apoA-I. In het metabolisme van menselijke lipoproteïneën bouwen circulerende ontluikende HDL’s lipiden op uit perifere cellen en rijpen ze tot bolvormige HDLs in een proces dat afhankelijk is van belangrijke eiwitmediatoren, waaronder de ATP-bindingscassettetransporter A1 en lecithine: cholesterolacyltransferse². Dit proces vertegenwoordigt een cruciaal onderdeel van de omgekeerde cholesteroltransportroute die wordt beschouwd als beschermend tegen hartaandoeningen. Gewapend met deze kennis en het vermogen om discoïdale HDLs te reconstitueren, hebben onderzoekers deze deeltjes gebruikt als een therapeutische interventie om atherosclerose³ te behandelen. In wezen bevordert de infusie van gereconstitueerd HDL (rHDL) bij patiënten cholesterolefflux uit plaqueafzettingen en brengt het terug naar de lever voor omzetting in galzuren en uitscheiding uit het lichaam. Verschillende biotechnologie/farmaceutische bedrijven volgen deze behandelingsstrategie⁴.

Tegelijkertijd heeft het vermogen om deze deeltjes in het laboratorium te genereren geleid tot een vlaag van onderzoeksactiviteiten die heeft geleid tot nieuwe toepassingen en nieuwe technologieën. Een prominente toepassing betreft het gebruik van rHDL-deeltjes als een miniatuurmembraan om transmembraaneiwitten te huisvesten in een native-achtige omgeving⁵. Tot op heden zijn honderden eiwitten met succes opgenomen in discoïdale rHDL, en onderzoek heeft aangetoond dat deze eiwitten zowel inheemse conformatie als biologische activiteit behouden als receptoren, enzymen, transporters, enz. Van deze deeltjes, aangeduid als “nanodiscs”, is ook aangetoond dat ze vatbaar zijn voor structurele karakterisering, vaak met een hoge resolutie⁶. Deze benadering van onderzoek naar transmembraaneiwitten wordt erkend als superieur aan studies met detergentenmicellen of liposomen en vordert als gevolg daarvan snel. Het is belangrijk om te erkennen dat er twee verschillende methoden zijn gemeld die in staat zijn om een rHDL te vormen. De “cholaatdialyse” methode¹³ is populair voor toepassingen die verband houden met de opname van transmembraaneiwitten in de rHDL bilayer⁵. In wezen omvat deze formuleringsmethode het mengen van een tweelaagse fosfolipide, een steigereiwit en het transmembraaneiwit van belang in een buffer die het detergent natriumcholaat (of natriumdeoxycholaat; micelmolecuulgewicht [MW] van 4.200 Da) bevat. Het reinigingsmiddel lost de verschillende reactiecomponenten effectief op, waardoor het monster kan worden gedialyseerd tegen buffergebrek aan reinigingsmiddel. Tijdens de dialysestap, als het wasmiddel uit het monster wordt verwijderd, vormt zich spontaan een rHDL. Wanneer deze benadering wordt gebruikt om een transmembraaneiwit van belang in de val te lokken, worden de productdeeltjes nanodiscs⁵ genoemd. Pogingen om deze methode te gebruiken om hydrofobe bioactieve stoffen met kleine moleculen (MW <1.000 Da) op te nemen, zijn echter grotendeels mislukt. In tegenstelling tot transmembraaneiwitten kunnen bioactieve stoffen met kleine moleculen samen met het wasmiddel uit de dialysezak ontsnappen, waardoor hun opname-efficiëntie in rHDLs sterk afneemt. Dit probleem werd opgelost door detergentia weg te laten uit het formuleringsmengsel¹⁴. In plaats daarvan worden de componenten achtereenvolgens aan een waterige buffer toegevoegd, te beginnen met de tweelaagse die lipide vormt, waardoor een stabiel bioactief middel wordt gevormd dat rHDL bevat, een nanoschijf genoemd. Anderen hebben rHDL gebruikt voor de opname en het transport van in vivo beeldvormende middelen⁷. Meer recent zijn gespecialiseerde rHDL, bestaande uit een apolipoproteïnesteiger en de anionische glycerofosfolipide, cardiolipine, gebruikt in ligandbindingsstudies. Deze deeltjes bieden een platform voor studies naar de interactie van cardiolipine met verschillende in water oplosbare liganden, waaronder calcium, cytochroom c en het antikankermiddel doxorubicine⁸.

De focus van deze studie ligt op de formulering van rHDL die een stabiel opgenomen hydrofoob bioactief middel (d.w.z. nanoschijf) bezitten. Het vermogen van deze middelen om te integreren in het lipidemilieu van discoïdale rHDL-deeltjes verleent ze effectief waterige oplosbaarheid. Als zodanig hebben nanoschijven het potentieel voor in vivo therapeutische toepassingen. Bij het formuleren van nanoschijven zijn specifieke incubatie- / reactieomstandigheden vereist om met succes discrete hydrofobe bioactieve stoffen in het productdeeltje op te nemen, en het doel van dit rapport is om gedetailleerde praktische informatie te bieden die kan worden gebruikt als een fundamentele sjabloon voor het maken van nieuwe nanoschijfdeeltjes voor specifieke toepassingen. In de context van dit manuscript zijn de termen nanodisc en nanodisk dus niet uitwisselbaar. Terwijl nanodisc verwijst naar een rHDL geformuleerd om een transmembraaneiwit te bevatten dat is ingebed in zijn lipide bilayer⁵, verwijst de term nanodisk naar een rHDL geformuleerd om hydrofobe bioactieve stoffen met een laag molecuulgewicht (< 1.000 Da) op te nemen, zoals amfotericine B¹⁴.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de verwerving van geschikte steigereiwitten. Het is mogelijk om steigereiwitten te kopen van fabrikanten [bijv. apoA-I (SRP4693) of apoE4 (A3234)], maar de kosten kunnen een beperkende factor zijn. Een voorkeursbenadering is om recombinante steigereiwitten tot expressie te brengen in Escherichia coli. Protocollen zijn gepubliceerd voor humaan apoA-I⁹, apoE4¹⁰, evenals het insect hemolymfe-eiwit apolipophorin-III¹¹. Voor de hierin beschreven experimenten werd gebruik gemaakt van recombinant humaan apoE4 N-terminale (NT) domein (aminozuren 1-183). De nucleotidesequentie die codeert voor menselijk apoE4-NT werd gesynthetiseerd en ingevoegd in een pET-22b (+) expressievector direct grenzend aan de vectorgecodeerde pelB-leidersequentie. Dit construct leidt tot de expressie van een pelB leader sequence-apoE4-NT fusie-eiwit. Na eiwitsynthese leidt de bacteriële pelB-leidersequentie het nieuw gesynthetiseerde eiwit naar de periplasmatische ruimte waar leider peptidase de pelB-sequentie splitst. Het resulterende apoE4-NT-eiwit, zonder sequentietags of staarten, ontsnapt vervolgens aan de bacteriën en hoopt zich op in het kweekmedium^11,12, waardoor de verwerking stroomafwaarts wordt vereenvoudigd.