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生化学

Extracción de microtúbulos modificados de células de mamíferos para estudiar complejos microtúbulos-proteínas mediante microscopía crioelectrónica

Published: March 03, 2023
doi:
10.3791/65126
, , ,
1Oncode Institute and Division of Biochemistry,Netherlands Cancer Institute

概要

Aquí, describimos un protocolo para extraer tubulina endógena de células de mamíferos, que pueden carecer o contener enzimas modificadoras de microtúbulos específicas, para obtener microtúbulos enriquecidos para una modificación específica. Luego describimos cómo los microtúbulos extraídos se pueden decorar con proteínas purificadas de unión a microtúbulos para preparar rejillas para la microscopía crioelectrónica.

Abstract

Los microtúbulos son una parte importante del citoesqueleto y están involucrados en la organización intracelular, la división celular y la migración. Dependiendo de las modificaciones postraduccionales, los microtúbulos pueden formar complejos con varias proteínas que interactúan. Estos complejos microtúbulos-proteínas a menudo están implicados en enfermedades humanas. La comprensión de la estructura de tales complejos es útil para dilucidar sus mecanismos de acción y puede estudiarse mediante microscopía crioelectrónica (crio-EM). Para obtener tales complejos para estudios estructurales, es importante extraer microtúbulos que contengan o carezcan de modificaciones postraduccionales específicas. Aquí, describimos un protocolo simplificado para extraer tubulina endógena de células de mamíferos modificadas genéticamente, que implica la polimerización de microtúbulos, seguida de sedimentación mediante ultracentrifugación. La tubulina extraída se puede utilizar para preparar rejillas de microscopio crioelectrónico con microtúbulos que están unidos a una proteína purificada de unión a microtúbulos de interés. Como ejemplo, demostramos la extracción de microtúbulos completamente tirosinados de líneas celulares diseñadas para carecer de las tres enzimas tubulinas destirosinizantes conocidas. Estos microtúbulos se utilizan para formar un complejo proteico con tubulina destirosinasa asociada a microtúbulos enzimáticamente inactivos en rejillas crio-EM.

Introduction

Los microtúbulos son una parte crucial del citoesqueleto; Están involucrados en diferentes funciones, como la migración y división celular, pero también contribuyen a la organización intracelular. Para adaptarse a diferentes destinos funcionales, los microtúbulos interactúan con una variedad de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP), enzimas y otras proteínas, a las que nos referiremos colectivamente como “proteínas que interactúan con microtúbulos”. La unión a microtúbulos de estas proteínas puede ser guiada por diferentes modificaciones de la tubulina, comúnmente conocidas como el “código de la tubulina”1. Ejemplos de esta preferencia son la quinesina mitótica asociada al centrómero (MCAK)2 y el dominio dineína-dinactina CAP-Gly de p1503, que se asocian preferentemente con la tubulina tirosinada, mientras que los motores de quinesina asociadas a la proteína E asociada al centrómero (CENP-E)4 y la quinesina-25 prefieren la tubulina que carece de la tirosina C-terminal.

Si bien se puede emplear una variedad de métodos para estudiar las interacciones microtúbulos-proteínas, la criomicroscopía electrónica (crio-EM) se usa a menudo para estudiar estas interacciones a una resolución casi atómica 6,7. En los últimos años, las estructuras crio-EM han revelado cómo proteínas motoras grandes como la dineína 8,9,10 y la quinesina 11, proteínas +TIP como EB312,13 y MCAK14, otras proteínas como Tau15,16, e incluso moléculas pequeñas como paclitaxel, peloruside y zampanolide 17 interactuar con los microtúbulos. Para estudiar las interacciones microtúbulos-proteína, los microtúbulos se extraen típicamente del cerebro porcino18. Después de esto, la mayoría de los estudios in vitro, incluidas las estructuras de microtúbulos crio-EM, se llevan a cabo utilizando tubulina cerebral porcina. Los resultados de estos estudios, por lo tanto, oscurecen la importancia de la naturaleza heterogénea de las modificaciones de la tubulina19 entre tejidos y tipos celulares. Esto crea un problema particular cuando se investiga una proteína que requiere o prefiere una modificación específica para unirse a los microtúbulos. Esto se puede ilustrar con tubulina tirosinada, el sustrato de la microtúbulo detirosinasa MATCAP.

La destirosinación es una modificación de la tubulina en la que falta el aminoácido tirosina C-terminal de la α-tubulina, lo que se asocia con la función mitótica, cardíaca y neuronal20. Si bien los microtúbulos completamente tirosinizados son el sustrato ideal para MATCAP, esto está ausente en gran medida en los microtúbulos disponibles comercialmente del cerebro porcino debido a la función de las vasohibinas 21,22 y MATCAP 23 detirosinasas en este tejido 22,23,24,25,26. Aunque la tubulina HeLa disponible comercialmente contiene principalmente microtúbulos tirosinados, podría ocurrir la destirosinación, y esta fuente de tubulina es, por lo tanto, menos adecuada para crear una muestra uniforme para el análisis crio-EM.

Para estimular la unión de MATCAP a los microtúbulos y crear una muestra homogénea para el análisis estructural, se buscó una fuente de microtúbulos que estuviera completamente tirosinizada. Para ello, se creó una línea celular deficiente en MATCAP y vasohibina, que se utilizó para extraer microtúbulos totalmente tirosinados. El procedimiento de extracción se basó en protocolos bien establecidos que utilizan ciclos repetidos de polimerización y despolimerización de los microtúbulos para extraer tubulina del tejido o células cerebrales 18,27,28,29,30, con un solo paso de polimerización y centrifugación sobre un cojín de glicerol. Usando MATCAP como ejemplo, demostramos cómo estos microtúbulos se pueden usar para estudios crio-EM. Para preparar rejillas crio-EM, se describe un protocolo de aplicación de dos pasos a una baja concentración de sal. Los métodos en este documento describen la extracción de microtúbulos personalizables en cantidades y pureza suficientes para realizar análisis crio-EM y proporcionan un protocolo detallado sobre cómo usar estos microtúbulos para crear complejos proteína-microtúbulos en rejillas crio-EM.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo. 1. Cultivo celular NOTA: Todo cultivo celular debe realizarse en una campana de flujo laminar estéril. Para seguir este protocolo, primero descongele un vial de células congeladas en un baño de agua a 37 °C. Aquí, utilizamos una línea celular HCT116 modificada genéticamente que carece de las tres enzimas destirosinizantes conocidas, VASH1, VASH2 y MATCAP, para crear tubulina tirosinizada. Preparar una placa de Ø 10 cm que contenga 10 ml del medio de cultivo celular apropiado.NOTA: En este protocolo, se utilizó DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) suplementado con FCS (suero fetal de ternera) al 10% v/v y antibiótico penicilina/estreptomicina (medio de cultivo) para la línea celular HCT116 modificada genéticamente. Cuente las células y siembre ~2.5 × 106 celdas viables (~20% de confluencia) en la placa preparada de 10 cm. Agite el plato suavemente para distribuir uniformemente las células. Incubar el plato en una incubadora de cultivo celular a 37 °C gaseada con 5% (v/v) deCO2 hasta que las células alcancen una confluencia del 80%-90%.NOTA: Normalmente, esto toma 3 días para las células HCT116, pero el tiempo podría depender de la densidad de siembra específica y la línea celular utilizada. Deseche el medio de cultivo celular con una pipeta o aspirador de vacío y lave el plato 2 x 5 ml de PBS.NOTA: Tenga cuidado de no dispensar el PBS con demasiada fuerza sobre la monocapa celular, ya que esto podría separar las células de la placa. Agregue 1-2 ml de tripsina e incube las células en la incubadora durante 2-5 minutos para separar las células. Agregue 2 ml del medio de cultivo a la placa para apagar la tripsina. Dividir la suspensión celular en tres a cinco partes iguales y volver a sembrarlas para expandir las células en medio de cultivo hasta obtener 6-12 placas confluentes de 15 cm. 2. Cosecha Lave las células suavemente con 10 ml de PBS (1x) para eliminar cualquier medio de cultivo celular. Separe las células de las placas incubándolas durante 5 min a temperatura ambiente con 3 ml de PBS helado suplementado con 5 mM EDTA (estéril/filtrado) y, posteriormente, utilizando un raspador celular. Recoja las células en un tubo de 50 ml sobre hielo y gire hacia abajo (10 min, 250 × g).Tenga en cuenta el volumen de las células cosechadas con la escala volumétrica en el tubo de 50 ml.NOTA: El volumen esperado puede estar entre ~0.5 ml y 4 ml. PASO DE PAUSA: Congelar rápidamente el pellet de la celda en LN2 y almacenar a -20 °C hasta su uso. Tenga en cuenta que el pellet de la célula se puede almacenar sólo durante unas pocas semanas o meses. Si el pellet se mantiene por más tiempo, entonces podría resultar en una disminución del rendimiento o en la ausencia de microtúbulos en absoluto. 3. Extracción de microtúbulos NOTA: Mantenga todo para los pasos 3.1-3.5 en hielo; todo desde el paso 3.6 en adelante debe mantenerse caliente (30-37 °C). Prepare 10 ml de tampón de lisis helada que contenga 100 mM PIPES/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF y una tableta inhibidora de proteasa (mini). Resuspenda el pellet de células cosechadas en un tampón de lisis 1:1 v/v (si tiene dudas sobre el volumen exacto, tome menos tampón de lisis en lugar de más). Lise las células por sonicación: 15 s encendido, 45 s apagado, amperio 30, cuatro ciclos (determine las condiciones experimentalmente y cambie de acuerdo con el sonicador).Después de la sonicación, recolecte una muestra para el análisis SDS-PAGE: 2 μL de lisado + 18 μL de agua + 5 μL de tampón de muestra 5x SDS.NOTA: Verifique bajo un microscopio óptico estándar si las células se han lisado completamente. Pipetear las células lisadas en un tubo centrífugo. Girar durante 1 h a 100.000 × g a 4 °C en un rotor de ultracentrífuga para eliminar el lisado.NOTA: Asegúrese de que todos los bolsillos del rotor estén secos y limpios para garantizar el equilibrio correcto de la centrífuga. Use una jeringa para extraer el lisado aclarado. Tenga cuidado de no molestar el pellet, así como la capa flotante en la parte superior.Recoger una muestra del lisado aclarado: 2 μL de lisado + 18 μL de agua + 5 μL de 5x tampón de muestra SDS. Enjuague cuidadosamente el pellet y recoja un poco del pellet girando una punta de pipeta P10 a través del pellet; añadir 200 μL de agua y 50 μL de tampón SDS. Complementar el sobrenadante del paso anterior con 1 mM GTP y 20 μM paclitaxel para polimerizar los microtúbulos; para un volumen de 1 ml, añadir 10 μL de paclitaxel de 2 mM y 10 μL de GTP de 100 mM.PRECAUCIÓN: El paclitaxel puede causar irritación de la piel, daño ocular grave, irritación respiratoria, defectos genéticos, daño al feto y daño a los órganos. La exposición prolongada o repetida causa daño a los órganos. No respire, rocíe ni desempolve la sustancia de ninguna manera. Use guantes de nitrilo de goma para evitar el contacto con la piel. Incubar el sobrenadante suplementado con GTP/paclitaxel durante 30 min a 37 °C para permitir que los microtúbulos se ensamblen. Durante este paso de incubación, deje que el rotor y la ultracentrífuga se calienten hasta 30 °C. Prepare el tampón amortiguador: Agregue 0.6 ml de glicerol a 0.4 ml de tampón de lisis y complemente la mezcla con paclitaxel de 20 μM. Precaliente el amortiguador a 37 °C. Añadir 800 μL de tampón de amortiguación a un tubo de ultracentrífuga. Pipetear el lisado suplementado con GTP/paclitaxel cuidadosamente en la parte superior del amortiguador.NOTA: Evite la mezcla del amortiguador y el lisado pipeteando muy suavemente. Girar durante 30 minutos a 100.000 × g a 30 °C en un rotor ultracentrífugo. Marque el borde orientado hacia afuera del tubo de centrifugación para reconocer fácilmente dónde debe formarse el pellet de microtúbulos. Retire el amortiguador con cuidado con una pipeta, teniendo cuidado de no alterar el pellet de microtúbulos.Recoger una muestra del tampón de amortiguación: 2 μL + 18 μL de agua + 5 μL de tampón de muestra 5x SDS. Lave el pellet cuidadosamente 3x con tampón de lisis caliente para eliminar el glicerol. Dispense suavemente el tampón caliente junto al pellet (sin enjuagar el líquido directamente sobre el pellet), gire el tubo varias veces para eliminar la mayor cantidad de glicerol posible del pellet y las paredes del tubo, y luego aspire y repita.NOTA: Si el glicerol no se lava correctamente, la rejilla se derretirá muy rápidamente bajo la iluminación de electrones. Esto podría evidenciarse por el alto movimiento de partículas, creando imágenes borrosas. Prepare el tampón de resuspensión con los siguientes ingredientes: 100 mM PIPES/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH y 1 mM MgCl2, y caliente el tampón a 37 °C. Resuspender suavemente el pellet lavado con una punta cortada en ~50 μL de tampón de resuspensión precalentado y mantener el tubo a 37 °C.Recoger una muestra de la fracción de pellet resuspendida: 2 μL + 18 μL de agua + 5 μL de 5x tampón de muestra SDS.CONSEJO: La punta cortada evita la rotura de los microtúbulos. Prepare un bloque calefactor metálico a 37 °C y guárdelo en una caja de poliestireno para que los tubos de muestra puedan transportarse fácilmente sin enfriarlos a temperatura ambiente. 4. Preparación de la rejilla crio-EM Prepare el dispositivo congelador de inmersión instalando el papel secante. Caliente el congelador de inmersión hasta 30 °C y ajuste la humidificación al 100%. Permita ~ 30 min para equilibrar la temperatura y la humedad. Prepare la configuración del congelador de inmersión en dos aplicaciones y ejecute todo el programa una vez para asegurarse de que la configuración esté configurada correctamente. Asegúrese de que la primera aplicación tenga una fuerza de 10, 2 s de tiempo de borrado y 0 s de tiempo de espera y que la segunda aplicación tenga una fuerza de 10, 6,5 s de tiempo de borrado y 10 s de tiempo de espera. Descarga incandescente las rejillas crioelectromagnéticas a 30 mA durante 60 s. Enfríe el conjunto del recipiente de poliestireno con LN2 y prepare etano líquido en una taza de metal condensando el gas etano en una taza de metal fría. Prepare un tampón de dilución con los siguientes componentes: 100 mM PIPES/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH y 1 mM MgCl2, y caliéntelo a 37 °C. Diluir la proteína que interactúa con microtúbulos 1:1 v/v con tampón de dilución justo antes de aplicarla a las rejillas para asegurar que la concentración de sal se reduzca (utilizamos una concentración final de sal de 50 mM de NaCl). Mantener la mezcla a 37 °C. Tome una rejilla descargada de brillo con pinzas de inmersión y haga clic en ellas en el congelador de inmersión. Coloque el recipiente de poliestireno con etano líquido en el congelador de inmersión y ejecute el programa preparado: primero aplique 3.5 μL de solución de microtúbulos a la rejilla, deje que el congelador de inmersión seque la rejilla, luego aplique inmediatamente 3.5 μL de proteína recién diluida y, por último, deje que el émbolo se seque y congele la rejilla en etano líquido. Transfiera las redes a una caja de almacenamiento de red y guárdelas en un dewar LN2 hasta que se cree la imagen.

Representative Results

Se investigó la tubulina detirosinasa MATCAP unida a microtúbulos tirosinados por crio-EM. Para ello, extrajimos microtúbulos completamente tirosinados de una línea celular HCT116 modificada genéticamente que carecía de las tres enzimas destirosinizantes conocidas, VASH1/2 y MATCAP. Utilizamos 6-12 platos confluentes de 15 cm para extraer los microtúbulos de aproximadamente 0,5-4 mL de pellet celular (Figura 1). Después de la segunda etapa de centrifugación (paso 3.11), esto produce un pellet visible pero pequeño y transparente (Figura 1I). El rendimiento de microtúbulos es típicamente ~ 75 μg. Si el pellet no es visible, esto podría indicar un problema en uno de los pasos anteriores, como una temperatura incorrecta de polimerización de microtúbulos, problemas con la calidad del GTP o paclitaxel utilizado, o la adición de demasiado tampón de lisis, lo que resulta en una concentración de tubulina que es demasiado baja para la polimerización. Para evaluar la calidad y concentración de los microtúbulos extraídos, analizamos muestras en un gel SDS teñido con Coomassie (Figura 2A). Estos análisis indicaron que los microtúbulos extraídos eran relativamente puros. La concentración interpolada de microtúbulos derivada de la cuantificación de BSA fue ~1,4 mg/ml. Esto concuerda bien con el número medido con un espectrofotómetro (Figura 2B, C). Los microtúbulos recién extraídos se pueden utilizar directamente para hacer muestras para crio-EM. Los microtúbulos deben verse intactos y abundantes en las micrografías. Para un análisis crio-EM adicional, es clave tener una densidad de microtúbulos baja por micrografía para evitar que los microtúbulos se crucen entre sí (Figura 3A). Los microtúbulos rotos o aquellos que no son visibles pueden indicar que los microtúbulos se despolimerizaron (por ejemplo, debido a una baja temperatura o hidrólisis GTP) o que los parámetros de transferencia y congelación por inmersión no se ajustaron correctamente. El fondo alrededor de los microtúbulos es denso, presumiblemente con tubulina no polimerizada. El peso molecular de MATCAP es de 53 kDa, y tiene un dominio catalítico globular justo por debajo del tamaño de un monómero de tubulina. Por lo tanto, la decoración de MATCAP en el microtúbulo podría detectarse visualmente. Los microtúbulos que no se unieron a MATCAP mostraron bordes “lisos”, mientras que los microtúbulos que se unieron a MATCAP tenían bordes “ásperos”, caracterizados por puntos densos en electrones en la superficie de los microtúbulos (Figura 3B). Los microtúbulos unidos a MATCAP y no unidos a MATCAP también podrían distinguirse en las clases 2D calculadas, aunque debido a la forma y el tamaño, esto podría diferir para otras proteínas que interactúan con microtúbulos (Figura 3C). Para confirmar que la densidad pertenece efectivamente a la proteína de interés, se puede aprovechar las estructuras determinadas o predichas experimentalmente. También sugerimos hacer una cuadrícula de control que contenga microtúbulos solo para comparar. Esto indica si los microtúbulos se polimerizaron y extrajeron intactos a una concentración suficientemente alta y que el proceso de congelación por inmersión se ejecutó correctamente. Notamos que la abundancia de microtúbulos disminuyó en las rejillas con una segunda aplicación de MATCAP. Figura 1: Guía visual de los pasos experimentales. (A) Pellet celular antes de la lisis; (B) células sonicadas en un tubo de ultracentrífuga antes de la centrifugación; (C) células sonicadas en un tubo de ultracentrífuga después de la centrifugación; (D) jeringa con el sobrenadante aclarado; E) pellets residuales después de la eliminación del sobrenadante, incluida una “capa flotante blanca”; F) Punta P10 con un pellet de restos celulares para el gel SDS Coomassie; G) sobrenadante suplementado con GTP/paclitaxel antes de la incubación; (H) sobrenadante incubado con GTP/paclitaxel sobre un cojín de glicerol en un tubo de ultracentrífuga; I) limpiar el pellet de microtúbulos después de la segunda etapa de centrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Determinación de la pureza y concentración de los microtúbulos . (A) Gel de página SDS teñido con Coomassie que muestra las muestras tomadas durante el protocolo de extracción y una comparación de concentración de BSA. S1 y P1 corresponden al sobrenadante y al pellet después de la primera etapa de centrifugación, respectivamente. S2 y P2 corresponden de manera similar a la segunda etapa de centrifugación. (B) Una línea de regresión no lineal de las cantidades relativas de BSA derivadas de A. La interpolación de la banda de microtúbulos alrededor de 50 kDa en el carril P2 (microtúbulos) indica una concentración final de 1,42 mg/ml. (C) El análisis espectrofotométrico de los microtúbulos resuspendidos (P2) medidos por dos personas y corregidos para el coeficiente de extinción combinado de TUBA1A y TUBB3 (0,971) indica una concentración media y desviación estándar de 1,46 mg/ml ± 0,14 mg/ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Ejemplos de micrografías. (A) Ejemplos de micrografías que muestran microtúbulos unidos a MATCAP. Los microtúbulos indicados por una caja verde están intactos, decorados y se pueden utilizar para el análisis crio-EM. El microtúbulo indicado por la caja naranja es un microtúbulo intacto y decorado, pero se coloca cerca de los microtúbulos que quedan de él; por lo tanto, es menos adecuado incluirlo en el análisis crio-EM. Los microtúbulos en la caja roja se cruzan y se rompen. Estos deben excluirse del análisis crio-EM. (B) Una vista ampliada del microtúbulo rodeado de verde del panel izquierdo. Las puntas de flecha rojas indican los puntos negros que solo aparecieron en los microtúbulos en las micrografías que tenían una aplicación de MATCAP y, por lo tanto, probablemente corresponden a MATCAP unido al microtúbulo. (C) Ejemplo de clases 2D de partículas de microtúbulos seleccionadas de A que mostraron una decoración alta y baja y una clase 2D de un conjunto de datos diferente para el cual no observamos ninguna decoración por MATCAP (panel más a la derecha). Barras de escala = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Análisis de inmunoblot de microtúbulos derivados de células HCT116 deficientes en MATCAP y VASH1/2 deficientes en triple knockout (TKO), cerebro porcino comercial y tubulina HeLa. Abreviaturas: TKO = triple nocaut; mAb = anticuerpo monoclonal; pAb = anticuerpo policlonal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este método describe cómo extraer rápidamente la tubulina endógena de las líneas celulares y posteriormente decorar esos microtúbulos en rejillas crio-EM. Los microtúbulos son sensibles a la temperatura. Se despolimerizan en un ambiente frío y polimerizan en un ambiente cálido31. Por lo tanto, es crítico ejecutar el espín de sonicación y aclaramiento (pasos 1.1-1.5) a 4 °C para solubilizar la tubulina. Si algún factor estabilizara los microtúbulos tan bien que no se despolimerizaran en este paso, estos microtúbulos y los factores estabilizadores se descartarían en el pellet después del giro inicial de aclaramiento. Después de (re)polimerizar los microtúbulos, es importante mantener caliente en todo momento la solución que contiene los microtúbulos polimerizados. Se extrajeron los microtúbulos de las células HCT116, que son deficientes en las proteínas VASH1, VASH2 y MATCAP. Otras líneas celulares, así como tejidos, se pueden utilizar para extraer microtúbulos29, aunque los contaminantes, los isotipos de tubulina y el rendimiento podrían ser muy diferentes de lo que se describe aquí. La sobreexpresión de plásmidos que contienen enzimas modificadoras también se puede utilizar para introducir modificaciones específicas de la tubulina.

Otros protocolos 18,27,28,29,30 utilizan múltiples ciclos de polimerización y despolimerización de los microtúbulos para obtener microtúbulos vacíos de otras proteínas que interactúan. Aquí, hemos simplificado estos protocolos y solo polimerizamos los microtúbulos una vez. Es posible que debido a esta polimerización única, estos microtúbulos puedan co-sedimentar con otras proteínas que interactúan con microtúbulos. Sin embargo, hemos encontrado que este protocolo proporciona microtúbulos suficientemente puros para fines crio-EM. Si se necesita una muestra más pura para ensayos específicos, ciclos adicionales de polimerización y despolimerización podrían producir una muestra más pura, aunque esto podría ser a expensas del rendimiento de microtúbulos. En este protocolo, utilizamos paclitaxel para polimerizar los microtúbulos. Sin embargo, paclitaxel podría sesgar la red de microtúbulos hacia un cierto giro y aumento, lo que podría interferir con la afinidad de los microtúbulos de la proteína de interés. Se podrían utilizar otros reactivos estabilizadores de microtúbulos si el paclitaxel no es adecuado; ejemplos de estos reactivos son moléculas no taxanas como peloruside o variantes GTP no hidrolizables como GMPCPP17,32.

Para investigar estructuralmente las proteínas que se unen a los microtúbulos en las rejillas crio-EM, es necesario unir una cantidad suficiente de la proteína de interés a los microtúbulos. Un problema común es que los complejos de proteínas que son estables en solución se desmoronan en la red. Para formar el complejo de proteínas en la rejilla, era crucial colocar primero los microtúbulos en capas y luego aplicar la proteína de unión a microtúbulos con una baja concentración de sal a la rejilla recubierta de microtúbulos, ensamblando así el complejo de proteínas directamente en la rejilla. Otros han informado de manera similar un protocolo33,34 bajo en sal y un protocolo de aplicación de dos pasos34,35,36 para una decoración exitosa de microtúbulos. Es probable que una menor concentración de sal sesgue el complejo proteico hacia una interacción más estable debido a la disminución de las cargas electrostáticas. Sin embargo, debido a la baja concentración de sal, la proteína de interés está en riesgo de precipitación. Por lo tanto, es muy recomendable mantener la proteína en o alrededor de concentraciones de sal fisiológicamente relevantes hasta poco antes de vitrificar las rejillas. Este protocolo de aplicación de dos pasos probablemente evita que el complejo de proteínas se deshaga durante los pasos de secado o congelación por inmersión. En este protocolo, utilizamos el Vitrobot. Sin embargo, los métodos de vitrificación más rápidos (VitroJet) o el uso de rejillas sin manchas (Puffalot) o dispositivos que tienen ambas propiedades (camaleón) podrían superar la aplicación de dos pasos, pero actualmente no están ampliamente disponibles para pruebas.

La resolución final de la densidad crio-EM reconstruida puede verse afectada por una serie de factores, incluido el movimiento de la proteína de unión a microtúbulos en relación con el microtúbulo y el nivel de decoración que se puede lograr. Una mayor decoración de microtúbulos es probablemente beneficiosa para la resolución final obtenida en la reconstrucción de densidad 3D. Esto puede estar limitado por unos pocos factores, como la concentración más alta de proteína que se obtiene durante la purificación de la proteína de unión a microtúbulos, la concentración de sal más baja que la proteína que interactúa con microtúbulos puede soportar sin agregar y el modo de unión de la proteína que interactúa con microtúbulos (por ejemplo, la proteína podría abarcar más de un dímero de tubulina, lo que dificulta una relación de unión de 1: 1). Aunque la resolución de la reconstrucción crio-EM podría verse comprometida por microtúbulos escasamente decorados, el análisis computacional puede eludir muchos problemas, como lo ejemplifica una estructura compleja microtúbulo-proteína recientemente reportada que estaba extremadamente escasamente decorada8.

El protocolo que describimos aquí presenta un método rápido y de bajo costo para obtener microtúbulos adecuados para fines crioelectromagnéticos. En contraste con la tubulina cerebral porcina disponible comercialmente, los microtúbulos derivados de las células HCT116 deficientes en MATCAP y deficientes en vasohibina están completamente tirosinadas (Figura 4). La tubulina comercial HeLa, un reactivo caro, en principio, está relativamente uniformemente tirosinizada y contiene pocas otras modificaciones4 como la glutamilación, pero los lotes pueden variar, y la modificación solo podría lograrse in vitro. Una ventaja de extraer microtúbulos de líneas celulares hechas a medida es la flexibilidad que se tiene para sobreexpresar o eliminar enzimas modificadoras de tubulina, como las detirosinasas de tubulina, para crear un conjunto más homogéneo de microtúbulos. Esto puede beneficiar la decoración y la uniformidad de la muestra crio-EM y, en última instancia, beneficiará la facilidad y la calidad de los mapas de densidad crio-EM y las estructuras moleculares derivadas de esta muestra.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los miembros de los grupos Sixma, Brummelkamp y Perrakis por sus fructíferas discusiones científicas y por proporcionar un ambiente de trabajo agradable, y específicamente, agradecemos a Jan Sakoltchik (“persona 2”) por ayudar a determinar la concentración de proteínas representada en la Figura 3C. También nos gustaría agradecer a la instalación crio-EM de NKI y al Centro Holandés de Nanoscopía Electrónica (NeCEN) en la Universidad de Leiden por su apoyo. Este trabajo fue apoyado por la subvención 016.Vici.170.033 de NWO Vici otorgada a T.R.B.. A.P. y T.R.B. son investigadores de Oncode y reciben fondos de NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. recibió fondos del Austrian Science Fund (FWF JB4448-B). Esta investigación fue apoyada por una subvención institucional de la Sociedad Holandesa del Cáncer y del Ministerio holandés de Salud, Bienestar y Deporte.

Materials

Material
0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Cell culture
10 cm plate Falcon 353003 Cell culture
15 cm plate Thermo FisherScientific 168381 Cell culture
50 mL tubes Sarstedt 62.547255 Cell culture
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 Quantifoil Micro Tools N1-C14nCu30-01 Cryo-EM grid preparation
Cell scrapers Falcon 353085 Cell culture
DMEM Gibco 41966-029 Cell culture
EDTA Merck 108418 Cell culture
EGTA Sigma Aldrich E3899 Microtubule extraction
Ethane gas Cryo-EM grid preparation
FCS Serana s-FBS-EU-015 Cell culture
Glycerol VWR 24.397.296 Microtubule extraction
GTP Fisher Scientific G8877-1G Microtubule extraction
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells self made Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 Cell culture
KOH Merck 1.05033 Microtubule extraction
MgCl2 Merck 105833 Microtubule extraction
Microtubule binding protein self made Cryo-EM grid preparation
Needle BD microlance 300600 Microtubule extraction
Paclitaxel Santa Cruz Biotechnology sc-212517 caution toxic, microtubule extraction
PBS Fisher Scientific BP399 Cell culture
Penicillin and streptomycin Sigma Aldrich P0781-100mL Cell culture
PIPES Merck P8203 Microtubule extraction
PMSF (in EtOH) Roche 16837091001 Microtubule extraction
SDS sample buffer self made Quality assessment
Syringe BD plastipak 309658 Microtubule extraction
Ultra protease tables mini Fisher Scientific NC0975224 Microtubule extraction
Whatman blotting paper Whatman 47000-100 Cryo-EM grid preparation
Equipment
Flow hood cell culture
GloQube Quorum Cryo-EM grid preparation
Grid storage box SWISSCI 41018 Cryo-EM grid storage
Heating block, electric or metal to warm the buffers
Incubator, cell culture NUAIR cell culture
LN2 dewar Cryo-EM grid storage
Plunge-tweezers Electron Microscopy Sciences 0508-L5-PS Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot
Polystyrene box  to keep the buffers warm
Sonicator Qsonica Q700 Microtubule extraction
Standard light microscope Olympus CKX 41 Quality assessment
TLA 100.3 rotor Beckman Coulter Microtubule extraction
TLA 120.2 rotor Beckman Coulter Microtubule extraction
Tubes for TLA 100.3 rotor Beckman Coulter 326819 Microtubule extraction
Tubes for TLA 120.2 rotor Beckman Coulter 347356 Microtubule extraction
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Microtubule extraction
Vitrobot FEI, ThermoFischer Scientific mark IV Cryo-EM grid preparation
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup ThermoFisher Scientific 200703 Cryo-EM grid preparation
Water bath cell culture
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参考文献

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Bak, J., Landskron, L., Brummelkamp, T. R., Perrakis, A. Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (193), e65126, doi:10.3791/65126 (2023).
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