多孔微电极阵列中人 体外 神经培养物的聚焦超声神经调控
1Electrical and Computer Engineering,Johns Hopkins University, 2HEPIUS Innovation Laboratory,Johns Hopkins University School of Medicine, 3Neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine, 4Biomedical Engineering,Johns Hopkins University School of Medicine, 5Mechanical Engineering,Johns Hopkins University, 6Anesthesiology and Critical Care Medicine,Johns Hopkins University School of Medicine
概要
在这里，我们提出了一种使用高通量系统的方案，该系统能够监测和量化聚焦超声对人类诱导的多能干细胞（HiPSC）神经元的神经调节作用。
Abstract
聚焦超声 （FUS） 的神经调节作用已在动物模型中得到证实，FUS 已成功用于治疗人类运动和精神疾病。然而，尽管FUS取得了成功，但其对神经元影响的机制仍然知之甚少，这使得通过调整FUS参数来优化治疗变得困难。为了解决这一知识差距，我们使用从人类诱导的多能干细胞（HiPSCs）培养的神经元 在体外 研究了人类神经元。使用HiPSC可以研究生理和病理状态下的人类特异性神经元行为。本报告介绍了一种使用高通量系统的方案，该系统能够监测和量化FUS对HiPSC神经元的神经调节作用。通过改变FUS参数并通过药物和基因修饰操纵HiPSC神经元，研究人员可以评估神经反应并阐明FUS对HiPSC神经元的神经调节作用。这项研究可能对开发安全有效的基于FUS的疗法，以治疗一系列神经和精神疾病产生重大影响。
Introduction
聚焦超声 （FUS） 是一种很有前途的神经调控方式，可在厘米级深度以亚毫米分辨率1、2、3 进行无创刺激。尽管有这些优势，但FUS的临床影响有限，部分原因是缺乏对其作用机制的了解。如果没有坚实的理论基础，研究人员和临床医生就很难定制治疗方案以满足不同条件下个体患者的特定需求。Yoo等人提出的一个 突出理论4表明，机械敏感离子通道负责神经元激活。然而，该理论无法解释人脑神经元中的FUS激活，而人脑神经元缺乏这些通道5。这种模糊性限制了 FUS 在临床上的使用，因为它排除了调整 FUS 参数以优化治疗结果。
先前的相关研究采用了一系列方法来研究支撑FUS的生理机制并确定最佳刺激参数。该过程中的一个关键步骤涉及监测神经元反应作为反馈，这可以通过涉及离子门监测的方法实现，例如钙离子成像4、光学成像1 和离体电生理记录（例如，肌电图6 或皮肤神经电生理学7）。然而，这些研究中的大多数使用非人类神经元或体内方法，由于次优控制，这可能会引入额外的差异。相比之下，使用电极测量体外人诱导多能干细胞 （HiPSC） 神经元中的神经元信号可提供更灵敏的测量和对实验环境的更好控制。在这项工作中，开发了一种使用微电极阵列 （MEA） 的体外系统来测量 FUS 刺激后 HiPSC 神经元的电反应，如图 1 所示。该系统使社区中的研究人员能够在改变超声参数（例如频率、脉冲长度、强度）时监测神经元反应。此外，该系统能够高度控制神经元对物理刺激（例如温度、压力和空化）的敏感性8,9，因为神经元的离子通道功能可以通过遗传和药物操纵（例如，使用钆抑制离子通道）10,11,12.这种分子水平的控制可能有助于阐明FUS神经调节作用背后的机制。
Protocol
1. 材料准备 吸出培养基，并用它填充嵌入MEA的24孔神经元培养板中的单个孔（图2A）。按照 Taga 等人发表的方案培养和诱导神经元13。 用70%乙醇对石蜡膜界面、橡皮筋和FUS锥体及其橡胶膜进行灭菌10分钟，然后将它们放入通风橱中以备后用。 脱气 300 mL 去离子水和 50 mL 偶联凝胶。将水和凝胶以160× g 离心5分钟，以避免在偶联介质内诱导空化。注：HiPSCs的原始来源来自GM01582和CIPS细胞系。平均而言，每孔可以达到 5 x 104 个运动神经元和 2.5 x 104 个星形胶质细胞的密度 14。 2. 外围设备的连接和设置 使用螺钉将 FUS 锥体固定到换能器上，并在通风的无菌罩中用柔性橡胶膜密封锥体。用步骤1.3中的脱气和去离子（DG-DI）水填充锥体，并确保锥体中没有气泡以避免气蚀。 使用定制的螺纹杆将 3D 打印支架固定到框架上（图 2B）。放置框架，使 FUS 传感器的头部位于将要受刺激的孔上方。 使用橡皮筋将封口膜固定在含有培养基和 HiPSC 的 24 孔 MEA 板上的孔上。 通过连接超声换能器的后端驱动电子设备来准备 FUS 系统，在本例中为换能器功率输出 （TPO; 图 3A） 到 100-240 V 电源插座（图 3B，连接 6），并将匹配网络连接到 TPO 和 FUS 传感器（分别为图 3B，连接 1 和连接 2）。匹配网络确保传感器和 TPO 之间的高效电气耦合。 将 MEA 系统连接到电源插座 （100-240 V）（图 3B，连接 5）。将 MEA 系统同步端口连接到 TPO（图 3B，连接 3）。此连接将使 MEA 系统的数据采集与 FUS 激励同步。 将 24 孔 MEA 板放入 MEA 系统中，然后取下盖子以使传感器和孔之间直接接触。如步骤3.2（图3A 和 图2B）所述，将换能器放置在孔板上方5-10 mm处，为脱气偶联凝胶留出空间。 3. 刺激和神经元信号采集 在 TPO 控制面板上设置 FUS 参数（表 1）。 将偶联凝胶涂在封口膜顶部，并将FUS换能器降低到偶联凝胶中，确保以最小的气泡与凝胶接触（图2A）。 通过单击用户界面上的 “开始” 按钮开始 MEA 系统录制。 通过按TPO上的右下角按钮（图3A，标签7）开始FUS超声处理，并在每轮超声处理之间等待至少5分钟，以使神经元恢复到基线状态。 使用FUS系统产生的触发脉冲将FUS刺激序列与MEA记录对齐（图3B，连接3）。 4. 数据处理与分析 使用 USB 连接将数据从 MEA 系统传输到计算机（图 3B，连接 4）。单击“ 实验设置 ”面板开始此操作。接下来，选择要记录的数据类型。在这种情况下，建议使用原始尖峰。最后，命名文件，并在磁盘驱动器中选择所需的位置以完成传输。注意：可以通过在 https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod 中运行已发布的 Python 脚本来执行以下步骤。 读取 16 个电极中每个电极的数据。 应用带宽为 5 Hz 至 3 kHz 的巴特沃斯带通滤波器，巴特沃斯阶数为 8。注意：要优化这些值，必须考虑特定单元的放电速率和所涉及的单元数量。通过将这两个值相乘，可以估计实验中细胞群的整体放电速率。 应用 σ = 3 的高斯滤波器以平滑信号。注：该参数可以根据 MEA 系统的推荐值进行优化，因为过度平滑可能会导致采集后的数据失真，而平滑过少会引入不需要的噪声。 设置一个阈值，以检测电位尖峰为高斯平滑信号标准差的 5 倍。 通过将所有 16 个通道的 50 ms 窗口中注册的尖峰数除以窗口长度（即 50 ms）来计算触发速率。将窗口沿信号移动到下一帧，然后重复发射速率计算（补充图1）。 根据与FUS相关的发射速率的变化，从传输的数据中读取FUS超声处理时间，从而分析信号。 5.多孔MEA板清洗和再利用 实验完成后，使用移液管小心地从多孔板中的孔中取出培养基，注意避开电极表面。 每口井加入 2 mL DG-DI 水。吸气并重复一次。 要去除任何细胞和碎屑，请向板中加入 1 g 酶洗涤剂 Terg-A-Zyme 与 10 mL 无菌 DG-DI 水（每孔 0.3 mL）的混合物。让它在室温 （RT） 下孵育过夜。 第二天，从孔中取出溶液，并用 1 mL 无菌 DG-DI 水冲洗。 孵育多孔板5-7分钟，然后抽吸。重复此步骤 5 次。 每孔加入 0.5 mL 无菌 DG-DI 水。记录清洁后的多孔板的基线，以验证MEA板是否清洁。清洁后的板应呈现低强度值的高斯噪声模式。 将清洁后的多孔板储存在4°C，直到准备再次使用。每月至少更换一次储存多边环境协定的水。
Representative Results
总之，我们提出了一种协议，可以使用从HiPSC培养的神经元进行 体外 FUS神经调控监测。 图 1 概述了刺激 HiPSC 诱导的神经元并记录相应的电响应以进行分析的整个系统平台。本研究的重点是神经元的FUS刺激和记录MEA系统中的电响应，如 图2所示。FUS和MEA系统的外围组件及其连接如 图3所示。 在神经元实验之前对焦点进行表征，以确保孔底完全被FUS焦点覆盖。如图4所示，应对热致变色片上的焦点进行可视化，以评估FUS系统。在焦点表征之后，应执行后处理步骤，包括滤波、阈值和计算发射速率，这些步骤总结在图 5 和图 6 中。这些步骤对于通过过滤环境中的噪声来检索有用的信号至关重要，从而深入了解由FUS引起的神经元活动变化。图6A-B中的栅格图显示了每个通道中检测到的尖峰。由于整个井底都在FUS换能器的焦点内，因此预计FUS应该改变所有电极的点火速率。这种放电速率的变化在图6C所示的放电速率图中可视化，这表明所选的刺激参数导致神经元放电速率的增加。具体来说，FUS（即基线）前的发射速率为140 Hz±116.7 Hz，而FUS后的发射速率为786 Hz±419.4 Hz，具有连续波FUS。此外，图6C显示了改变FUS参数（例如，使用脉冲波FUS而不是连续波）如何改变放电速率的变化幅度，以及改变神经元恢复到其基线状态之前的时间量。低强度聚焦超声 （LIFU） 不会导致培养物显着变暖，尤其是与旨在实现热损伤的高强度聚焦超声相比。理论计算和模拟支持缺乏具有临床影响的温度变化（补充图2）。即使在表1中列出的实验FUS参数的极端情况下，也只能观察到温度的最小升高约0.04°C。 使用放电率图可以量化 FUS 的神经调节作用，并可用于区分兴奋性和抑制性反应。多孔 MEA 板的一个显着优点是可以多次重复使用，以高通量方式研究不同的神经元状态和刺激参数。 图1：用于孔中神经元聚焦超声（FUS）神经调控的 体外 平台概述，以及使用微电极阵列测量其神经元活动。 每个电极（红线、绿线和蓝线）记录单个孔内的神经元群。实现了一个处理管道，将原始神经元电记录转换为神经元放电模式的检测。 请点击这里查看此图的较大版本. 图2：使用多孔微电极阵列（MEA）进行FUS神经调控。 （A）使用多孔MEA进行FUS神经调控的设置示意图。FUS换能器产生的声波通过充满脱气水的FUS锥体传播，并使用超声波凝胶进行耦合。使用橡皮筋将封口膜固定在井上以防止污染。MEA板将神经元的电记录发送到MEA系统。（B） MEA系统中多孔板上的FUS换能器照片。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 3： 体外 平台设置。 （A） 体外 平台设置的正面。传感器功率输出（TPO;左）用于对FUS参数进行编程。MEA系统（右）记录孔板中神经元的电活动，这些神经元由FUS换能器进行神经调节。（B） 体 外 平台设置的背面，具有从匹配网络 （1） 到 TPO 和 （2） 到传感器的连接。（3）MEA系统与TPO的连接使数据采集同步。（4） 从MEA系统到计算机的连接，用于数据传输。（5） MEA系统的电源连接。（6） FUS系统的电源连接。（7） 超声按钮。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 4：FUS 传感器的特性。 （A） 使用表 1 中详述的 FUS 参数的焦点压力图，由 AMPLITUDE 系统15 测量。（B） 使用图 3 所示的实验装置对放置在井底部的热致变色片进行预声处理和超声处理后。热致变色片会随着温度的变化而改变颜色，这为神经元位置的成功刺激提供了视觉验证。调整了 30 W/cm 2 的最大空间峰值脉冲平均强度 （ISPPA） 和 3 分钟的连续超声处理，以大幅改变局部温度，以便更好地观察此类焦点。请点击这里查看此图的较大版本. 图 5：处理管道。 第 1 步：从 N = 16 个通道捕获原始电气记录。后续步骤显示使用通道 16（以红色概述）的过程。第 2 步：对于每个通道，应用巴特沃斯带通滤波器（5 Hz 至 3 kHz 带通），然后应用高斯滤波器 （σ = 3）。阈值设置为在超声处理开始时为中心的 2 s 窗口内信号标准偏差的五倍。第 3 步：高于或低于阈值的信号被描述为尖峰。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 6：栅格图和发射速率图。 （A） 每个通道处检测到的尖峰的栅格图，作为超声处理时间的函数。FUS刺激的时间用红线标注。（B）不同FUS设置下连续FUS下的神经元光栅图进行比较。（C） 使用 50 ms 滑动窗口计算发射速率。FUS神经调节前后的平均放电速率分别为140 Hz和786 Hz。使用脉冲 FUS，平均发射速率为 230 Hz 和 540 Hz。观察到这组不同的FUS刺激诱导了更短的激活和更少的速率变化。点火率的计算过程详见 补充图1。 请点击这里查看此图的较大版本. 参数 价值 最大功率/通道 1.200 瓦 P实际 0.749 W/通道。 我SPPA 10.79 瓦/厘米2 我SPTA 0.05 瓦/厘米2 突发长度 0.100 毫秒 频率 250.00 千赫兹 重点 39.800 毫米 时期 20.000 毫秒 定时器 60.000 秒 表 1： 图 4 所示研究的 TPO 上设置的聚焦超声 （FUS） 参数。 补充图 1：从栅格图到点火速率的处理。 第 1 步：计算所有通道中的尖峰，以获得给定滑动窗口内的计数数。注意：在这里，选择了更大的滑动窗口（设置为0.1秒）以获得更好的说明。第 2 步：将每个窗口长度的尖峰转换为每秒尖峰（例如，在这里，将计数乘以 10 转换为赫兹 [Hz]，然后除以 1,000 得到以千赫兹 [kHz] 为单位的值）。第 3 步：获得结果的发射速率曲线。GitHub （https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod） 上提供了开源工具包以及采样数据。 请点击此处下载此文件。 补充图 2：LIFU16 的 K 波模拟结果温度曲线。 根据 图4所示的声强图，K波模拟结果表明，使用 表1中列出的实验FUS参数的极端情况，焦点区域中心区域（半径：2 mm）的最大温度升高为0.04 °C。 请点击此处下载此文件。
Discussion
本手稿描述了一种可用于记录 FUS 神经调控期间 HiPSC 神经元活动的新方法。该协议可推广到不同的FUS传感器和MEA系统。为了复制使用所述方案观察到的结果，研究人员应确保换能器的焦点大于MEA井底部的面积。此外，如果使用不同的神经元细胞系，则滤波器参数必须调整为孔内细胞的预期频率响应。如果无法获得具有代表性的结果，则应考虑修改上述参数（例如，突发长度、强度、占空比等）。
尽管这项工作证明了FUS刺激后发射速率的增加，但在得出任何结论之前，必须收集更多的数据来证明这一发现的可重复性。该协议继承了MEA系统的局限性，MEA系统通常具有直接微电极电流信号记录的弱点。虽然与神经元的直接接触提供了更好的灵敏度，但它可能会改变细胞并影响测量精度。此外，由于孔的尺寸较小，我们的系统不包括外周组织，外周组织也可能在神经调控中发挥作用17。这可能会限制从该设置得出的结论在 体内 环境中的适用性。为了研究更复杂的网络响应，必须设计更高通道密度的MEA系统以提高其灵敏度18。已经确定了该拟议系统的几个未来方向，包括使用3D龙门架来固定换能器并确保准确放置19。可以对后处理算法进行其他改进，包括利用脉冲排序算法20 对单个神经元进行分类。这一过程将有助于在未来对FUS机制的研究中解开多单元神经元的反应。最重要的是，必须结合其他刺激方式，如化学、电和光学刺激，以阐明潜在的机制。这些方法可以改变神经元的性质和行为，例如通过抑制特定的离子通道15 或改变膜特性21。通过调节假设的信号通路中的主要因素，研究人员可以确定每个因素在受控环境中的贡献，并最终阐明起作用的复杂相互作用。
电刺激22 是最成熟的神经调控技术之一，在临床和研究环境中有着悠久的成功应用历史。相比之下，FUS和光遗传学23 是近年来受到关注的相对较新的模式。FUS的主要优点是其非侵入性，并且能够在其他技术（包括电刺激和光遗传学）难以达到的深度刺激神经元。然而，与光遗传学24 一样，FUS 在模拟波传播和相关神经元反应方面存在一些局限性。 在体内 捕获组织异质声学特性的复杂性可能具有挑战性，这会导致压力场的不确定性，从而导致神经元反应的不确定性。在针对特定实际应用优化技术时，准确建模这些属性的困难带来了挑战。固有的复杂性强调了像本研究中这样的 体外 系统的重要性，因为它们可以直接研究受控声强度条件下的响应。
总之，该系统为研究FUS对人类神经元的神经调节作用提供了一个高通量 的体外 平台。通过该系统，可以通过测量人类神经元在受控环境中暴露于不同水平和类型的刺激时的电反应来探索FUS的作用机制。因此，它为该领域常用的人类和动物模型提供了有价值的补充工具。
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Amir Manbachi 和 Nitish Thakor 感谢国防高级研究计划局 DARPA 的资助支持，授予合同：N660012024075。此外，Amir Manbachi 还感谢约翰霍普金斯大学临床与转化研究所 （ICTR） 的临床研究学者计划 （KL2） 的资金支持，该计划由美国国立卫生研究院 （NIH） 国家转化科学促进中心 （NCATS） 管理。Nitish Thakor 感谢美国国立卫生研究院 （NIH） 的资金支持：R01 HL139158-01A1 和 R01 HL071568-15。
Materials
| MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
| MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
| Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
| CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
| Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
| HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
| Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
| Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
| Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
| Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
| Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
| Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
| Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
| Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
| Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
| Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
| Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
| Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
| Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
| Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
| Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
| Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |
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記事を引用
Liang, R., Mess, G., Punnoose, J., Kempski Leadingham, K. M., Smit, C., Thakor, N., Habela, C. W., Tyler, B., Salimpour, Y., Manbachi, A. Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (207), e65115, doi:10.3791/65115 (2024).