Isolatie van extracellulaire blaasjes met een laag endotoxinegehalte afgeleid van kankercellijnen

Extracellulaire blaasjes (EV’s), volgens de MISEV 2018-nomenclatuur, zijn een verzamelnaam die verschillende subtypen van door cellen uitgescheiden vliezige blaasjes beschrijft die een cruciale rol spelen in tal van fysiologische en pathologische processen ^1,2. Bovendien zijn EV’s veelbelovend als nieuwe biomarkers voor verschillende ziekten, evenals therapeutische middelen en voertuigen voor medicijnafgifte. Het realiseren van hun volledige potentieel is echter moeilijk omdat er nog steeds veel technische obstakels zijn met betrekking tot hun overname³. Een van die uitdagingen is de isolatie van endotoxinevrije EV’s, die in veel gevallen is verwaarloosd. Een van de meest voorkomende endotoxinen is lipopolysaccharide (LPS), dat een belangrijk onderdeel is van gramnegatieve bacteriële celwanden en een acute ontstekingsreactie kan veroorzaken, als gevolg van de afgifte van een groot aantal inflammatoire cytokines door verschillende cellen ^4,5. LPS induceert een respons door binding aan LPS-bindend eiwit, gevolgd door interactie met het CD14/TLR4/MD2-complex op myeloïde cellen. Deze interactie leidt tot de activering van MyD88- en TRIF-afhankelijke signaalroutes, die op hun beurt de nucleaire factor kappa B (NFkB) activeren. Translocatie van NFkB naar de kern initieert de productie van cytokines⁶. Monocyten en macrofagen zijn zeer gevoelig voor LPS en hun blootstelling aan LPS resulteert in een afgifte van inflammatoire cytokines en chemokines (bijv. IL-6, IL-12, CXCL8 en TNF-α)^7,8. De CD14-structuur maakt de binding van verschillende LPS-soorten met vergelijkbare affiniteit mogelijk en dient als co-receptor voor andere toll-like receptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 en 9)⁶. Het aantal studies dat wordt uitgevoerd naar de effecten van EV’s op monocyten/macrofagen neemt nog steeds toe^met 9,10,11. Vooral vanuit het perspectief van het bestuderen van de functies van monocyten, hun subpopulaties en andere immuuncellen, is de aanwezigheid van endotoxine en zelfs hun gemaskeerde aanwezigheid in EV’s van groot belang¹². De over het hoofd geziene besmetting van EV’s met endotoxinen kan leiden tot misleidende conclusies en hun ware biologische activiteit verbergen. Met andere woorden, het werken met monocytische cellen vereist vertrouwen in de afwezigheid van endotoxinebesmetting¹³. Potentiële bronnen van endotoxinen kunnen water, commercieel verkregen media en sera, mediacomponenten en additieven, laboratoriumglaswerk en plasticware^zijn 5,14,15.

Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een protocol voor de isolatie van laag-endotoxine-bevattende EV’s. Het protocol geeft eenvoudige tips over hoe endotoxinebesmetting tijdens EV-isolatie kan worden voorkomen in plaats van endotoxinen uit EV’s te verwijderen. Eerder zijn veel protocollen gepresenteerd over het verwijderen van endotoxinen uit bijvoorbeeld gemanipuleerde nanodeeltjes die worden gebruikt in de nanogeneeskunde; geen van hen is echter nuttig voor biologische structuren zoals EV’s. De effectieve depyrogenering van nanodeeltjes kan worden uitgevoerd door ethanol- of azijnzuurspoeling, verwarming bij 175 °C gedurende 3 uur, γ bestraling of triton X-100-behandeling; deze procedures leiden echter tot de vernietiging van EV’s^16,17.

Het gepresenteerde protocol is een baanbrekend onderzoek gericht op het vermijden van endotoxine onzuiverheden in EV’s, in tegenstelling tot eerdere studies over het effect van EV’s op monocyten⁹. Het toepassen van voorgestelde principes op de laboratoriumpraktijk kan helpen om betrouwbare onderzoeksresultaten te verkrijgen, wat cruciaal kan zijn bij het overwegen van het potentiële gebruik van EV’s als therapeutische middelen in de kliniek¹².