Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

MISEV 2018 terminolojisine göre hücre dışı veziküller (EV’ler), çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçte çok önemli rol oynayan hücre salgılanan membranöz veziküllerin çeşitli alt tiplerini tanımlayan kolektif bir terimdir ^1,2. Dahası, EV’ler çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler, terapötik ajanlar ve ilaç dağıtım araçları olarak umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü satın almalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır³. Böyle bir zorluk, birçok durumda ihmal edilen endotoksin içermeyen EV’lerin izolasyonudur. En yaygın endotoksinlerden biri, gram-negatif bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşeni olan ve^{çeşitli hücreler tarafından} çok sayıda enflamatuar sitokinin salınması nedeniyle akut enflamatuar yanıta neden olabilen lipopolisakkarittir (LPS) ^4,5. LPS, LPS bağlayıcı proteine bağlanarak bir yanıt indükler, ardından miyeloid hücreler üzerinde CD14 / TLR4 / MD2 kompleksi ile etkileşime girer. Bu etkileşim, MyD88 ve TRIF’e bağımlı sinyal yollarının aktivasyonuna yol açar ve bu da nükleer faktör kappa B’yi (NFkB) tetikler. NFkB’nin çekirdeğe translokasyonu, sitokinlerin üretimini başlatır⁶. Monositler ve makrofajlar LPS’ye karşı oldukça hassastır ve LPS’ye maruz kalmaları enflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin (örneğin, IL-6, IL-12, CXCL8 ve TNF-α⁾ salınımına neden ^olur7,8. CD14 yapısı, benzer afiniteye sahip farklı LPS türlerinin bağlanmasını sağlar ve diğer toll-like reseptörleri (TLR’ler) için bir ko-reseptör görevi görür (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ve 9)⁶. EV’lerin monositler / makrofajlar üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmaların sayısı hala^artmaktadır 9,10,11. Özellikle monositlerin, alt popülasyonlarının ve diğer bağışıklık hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek açısından bakıldığında, EV’lerde endotoksin varlığı ve hatta maskelenmiş varlığı büyük önem taşımaktadır¹². EV’lerin endotoksinlerle göz ardı edilen kontaminasyonu, yanıltıcı sonuçlara yol açabilir ve gerçek biyolojik aktivitelerini gizleyebilir. Başka bir deyişle, monositik hücrelerle çalışmak, endotoksin kontaminasyonunun yokluğunda güven gerektirir¹³. Endotoksinlerin potansiyel kaynakları su, ticari olarak elde edilen ortam ve serumlar, ortam bileşenleri ve katkı maddeleri, laboratuvar cam eşyaları ve plastik eşyalar olabilir ^5,14,15.

Bu nedenle, bu çalışma düşük endotoksin içeren EV’lerin izolasyonu için bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Protokol, endotoksinleri EV’lerden çıkarmak yerine, EV’lerin izolasyonu sırasında endotoksin kontaminasyonunun nasıl önleneceğine dair basit ipuçları sağlar. Daha önce, endotoksinlerin, örneğin nanotıpta kullanılan mühendislik nanopartiküllerinden nasıl çıkarılacağına dair birçok protokol sunulmuştu; ancak, hiçbiri EV’ler gibi biyolojik yapılar için yararlı değildir. Nanopartiküllerin etkili depirojenasyonu, etanol veya asetik asit durulama, 3 saat boyunca 175 ° C’de ısıtma, γ ışınlama veya triton X-100 muamelesi ile gerçekleştirilebilir; ancak, bu prosedürler EV’lerin ^16,17’nin tahrip olmasına yol açmaktadır.

Sunulan protokol, EV’lerin monositler üzerindeki etkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların aksine, EV’lerde endotoksin safsızlıklarından kaçınmaya odaklanan öncü bir çalışmadır⁹. Önerilen ilkelerin laboratuvar uygulamalarına uygulanması, EV’lerin klinikte terapötik ajanlar olarak potansiyel kullanımı göz önüne alındığında çok önemli olabilecek güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olabilir¹².