Modello post-resezione recidiva di glioblastoma per indagini terapeutiche sull'idrogel

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e supervisionati dall’Institutional Review Board e dall’Animal Ethics Committee dell’Università di Medicina di Nanchino (IACUC-1904004). Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL / 6J, di età compresa tra 6 e 8 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). 1. Preparazione degli animali Pesare i topi e anestetizzarli con un’iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital sodico (vedere Tabella dei materiali). Somministrare meloxicam (5mg/kg; i.p.) per l’analgesia perioperatoria. Ospitare i topi in una gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore, una temperatura ambiente di 24 °C e un’umidità relativa del 50%.NOTA: Per il presente studio, il peso iniziale dei topi era di circa 22 g. Rimuovere i peli sulla testa di un topo usando un rasoio per animali da laboratorio e fissare la testa e gli arti sull’apparato stereotassico (vedi Tabella dei materiali).NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell’uso. Disinfettare la testa del topo con almeno tre cicli alternati di clorexidina o scrub povidone-iodio seguiti da alcool e coprire il topo con un drappo chirurgico sterile. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l’essiccazione. Tagliare il cuoio capelluto del topo di circa 1 cm lungo la linea mediana sulla parte superiore della fronte destra con le forbici oftalmiche.NOTA: Confermare il piano chirurgico dell’anestesia dall’assenza di riflesso del pedale prima di effettuare l’incisione. Sintonizzare l’apparato stereotassico per assicurarsi che la cucitura a spina di pesce e il punto della fontanella anteriore si trovino allo stesso livello. 2. Costruzione del modello ortotopico di GBM intracranico Segnare il punto 1 mm sul lato anteriore della fontanella anteriore, 1,8 mm sul lato destro della fontanella anteriore e 3 mm verso il basso rispetto alla fontanella anteriore usando un batuffolo di cotone imbevuto di violetto genziana2 (vedi Tabella dei materiali). Forare il punto utilizzando un mini trapano cranico da 1 mm di diametro (vedere la tabella dei materiali) per creare una dimensione dei pori di circa 1 mm di diametro e 1 mm di profondità. Rimuovere il liquido cerebrospinale essudato con un batuffolo di cotone sterile. Aspirare 5 μL di sospensione di cellule tumorali (GL261-Luci, 5 × 10 5 cellule sospese in5 μL di PBS) con una microsiringa.NOTA: Il GL261-Luci è stato ottenuto da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Allineare verticalmente la punta dell’ago della microsiringa con il foro di perforazione del cranio, inserire fino a quando la punta dell’ago entra nel piano del cranio per 3 mm e riportare l’ago di 0,5 mm7. Aprire la microsiringa e iniettare con una velocità di 1 μL/min. Trattenere l’ago per 10 minuti dopo l’iniezione. Prelevare lentamente la microsiringa e premere il punto di iniezione con un batuffolo di cotone asciutto sterile. Suturare il cuoio capelluto con una sutura chirurgica non assorbibile (10-0, vedi Tabella dei materiali) e disinfettare nuovamente l’incisione. Monitorare la salute dell’animale e tenerlo in condizioni calde. Spostare nuovamente il mouse nella gabbia dell’alloggiamento dopo che il mouse si è risvegliato. Immagina il topo con un sistema di imaging bioluminescente in vivo (vedi Tabella dei materiali) per rilevare il tumore trapiantato il 10 ° giorno dopo il tumore.NOTA: La luciferasi caricata nelle cellule GBM, GL261, è stata utilizzata per l’imaging bioluminescente.Anestetizzare il topo con isoflurano all’1,5% con una portata di ossigeno di 0,6 L/min. Dopo aver confermato la profondità dell’anestesia attraverso la mancanza di riflesso del pedale, iniettare il topo per via intraperitoneale con fluoresceina di potassio (10 mg / ml, vedere Tabella dei materiali) e 11 s dopo, eseguire l’imaging bioluminescente in vivo . Quando il valore di fluorescenza raggiunge ~ 5 × 105, la procedura ha esito positivo.NOTA: Anestetizzare l’animale prima dell’imaging. Mantenere l’anestesia tramite cono nasale fornito con isoflurano vaporizzato. Selezionare i topi con successo il portatore tumorale per costruire il modello di post-resezione di recidiva GBM. 3. Costruzione del modello GBM relapse post-resection Quando la dimensione del tumore nei topi modello di GBM intracranico ortotopico diventa ~ 6,5 × 105, selezionare i topi per il modello di recidiva postoperatoria. Pesare i topi modello di GBM intracranico ortotopico e anestetizzare i topi con un’iniezione intraperitoneale di 50 mg / kg di pentobarbital sodico. Somministrare meloxicam (5mg/kg; i.p.) per l’analgesia perioperatoria. Ripetere il processo dei passaggi 1.2-1.5. Separare il tessuto del cuoio capelluto e il cranio e controllare il foro di perforazione utilizzato per costruire il modello ortotopico di GBM intracranico. Se il foro è guarito, identificarlo usando un apparecchio stereotassico e seguire la procedura descritta nei punti 2.1-2.3. Espandere il diametro del foro a 5 mm con un trapano cranico e rimuovere il liquido cerebrospinale essudato con un batuffolo di cotone sterile. Focalizzare il microscopio sulla testa del mouse e regolare le impostazioni per assicurarsi che il foro di perforazione si trovi al centro del campo visivo. Tagliare le meningi con microforbici e rimuovere parte del tessuto tumorale con una micro curette e un micro bisturi al microscopio.NOTA: Per quanto riguarda le meningi, quando il cranio viene aperto, la sottile membrana vicino al tessuto cerebrale sono le meningi. Fermare l’emorragia con una garza sterile e lavare l’incisione con soluzione fisiologica sterile. Iniettare l’idrogel disponibile in commercio (10 μL, vedere Tabella dei materiali) nella cavità di resezione con una siringa da 1 ml, suturare il cuoio capelluto con una sutura chirurgica non assorbibile (10-0) e disinfettare nuovamente l’incisione (Figura 1). Monitorare la salute dell’animale e tenere il mouse al caldo. Spostare nuovamente il mouse nella gabbia dell’alloggiamento dopo che il mouse si è risvegliato. Eseguire l’imaging bioluminescente in vivo per rilevare il tumore trapiantato 1 giorno dopo per quantificare la dimensione del tumore residuo (Figura 2 e Figura 3). Pesare i topi ogni 2 giorni fino all’endpoint terminale.NOTA: Per il presente studio, l’endpoint terminale era il giorno 30 e i topi sono stati sottoposti a eutanasia da un sovradosaggio di pentobarbital sodico con un’iniezione intraperitoneale.