Standaardisatie van overdracht tussen laboratoria tussen flowcytometers voor detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis gevaccineerde kinderen
概要
In deze studie werd een methode ontwikkeld om de overdracht van experimentele instellingen en analysesjablonen tussen twee flowcytometers in twee laboratoria voor de detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis-gevaccineerde kinderen te vergemakkelijken. De standaardisatiemethode voor de flowcytometerexperimenten zal het mogelijk maken om onderzoeksprojecten effectief uit te voeren in meerdere centra.
Abstract
Een toenemend aantal laboratoria moet gegevens verzamelen van meerdere flowcytometers, vooral voor onderzoeksprojecten die in meerdere centra worden uitgevoerd. De uitdagingen van het gebruik van twee flowcytometers in verschillende laboratoria omvatten het gebrek aan gestandaardiseerde materialen, softwarecompatibiliteitsproblemen, inconsistenties in instrumentinstellingen en het gebruik van verschillende configuraties voor verschillende flowcytometers. Om een gestandaardiseerd flowcytometrie-experiment op te zetten om de consistentie en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten over meerdere centra te bereiken, werd een snelle en haalbare standaardisatiemethode vastgesteld om parameters over verschillende flowcytometers over te dragen.
De methoden die in deze studie werden ontwikkeld, maakten de overdracht van experimentele instellingen en analysesjablonen mogelijk tussen twee flowcytometers in verschillende laboratoria voor de detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis (JE) -gevaccineerde kinderen. Een consistente fluorescentie-intensiteit werd verkregen tussen de twee cytometers met behulp van fluorescentiestandaardparels om de cytometerinstellingen vast te stellen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in twee laboratoria met verschillende soorten instrumenten. Met behulp van deze methode kunnen we de analyse voor het evalueren van de immuunfunctie van JE-gevaccineerde kinderen in verschillende laboratoria met verschillende instrumenten standaardiseren, de verschillen in gegevens en resultaten tussen flowcytometers in meerdere centra verminderen en een haalbare aanpak bieden voor de wederzijdse accreditatie van laboratoriumresultaten. De standaardisatiemethode van flowcytometerexperimenten zal zorgen voor de effectieve uitvoering van onderzoeksprojecten in meerdere centra.
Introduction
De standaardisatie van flowcytometrie is nuttig voor de vergelijkbaarheid van resultaten verkregen van verschillende cytometers in verschillende laboratoria en studiecentra, en bevorderlijk voor de wederzijdse erkenning van resultaten om de werkefficiëntie te verbeteren. Steeds meer scenario’s vragen om standaardisatie. Tijdens het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen is standaardisatie van flowcytometrie belangrijk, omdat een ontwikkelde en gevalideerde test het hele ontwikkelingsproces van geneesmiddelen van preklinische tot klinische analyse zal ondersteunen. Flowcytometrische methoden worden vaak overgedragen tussen de farmaceutische industrie en samenwerkende laboratoria1. Bovendien is het essentieel om vergelijkbare gegevens te verkrijgen uit multicentrische klinische studies. In het Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project is bijvoorbeeld een standaardisatieworkflow ontwikkeld om vergelijkbare gegevens uit multicentrische flowcytometrie2 te verkrijgen.
De standaardisatie van flowcytometriemethoden is een uitdaging. De uitdagingen die in laboratoria worden ervaren, worden toegeschreven aan het gebrek aan gestandaardiseerde materialen, softwarecompatibiliteitsproblemen, inconsistenties in instrumentconfiguratie en het gebruik van verschillende configuraties tussen verschillende flowcytometers en divergente gatingstrategieën tussen de centra 3,4. Daarom is het belangrijk om een gap-analyse tussen laboratoria uit te voeren. Monstertoegang, kwaliteitssystemen, personeelskwalificaties en instrumentconfiguratie moeten worden herzien om ervoor te zorgen dat aan de vereisten wordt voldaan.
Op dit moment hebben kinderen die zijn gevaccineerd met het Japanse encefalitis (JE) -vaccin een significant verminderde incidentie van JE5. Het monitoren van perifere bloedimmuuncellen kan helpen bij het begrijpen van de veranderingen in celgemedieerde adaptieve immuniteit na vaccinatie, en de correlatie tussen de veranderingen in perifere bloedlymfocytensubsets en de effecten van vaccinatie. Vanwege de beperkte stabiliteit van volbloedmonsters worden evaluaties van de werkzaamheid van het vaccin vaak in meerdere centra uitgevoerd. Voor deze analyse definieerden we naïeve CD8+ of CD4+ T-cellen als CD27+ CD45RA+, centrale geheugen T-cellen (T CM) als CD27+ CD45RA-, effectorgeheugen T-cellen (TEM) als CD27- CD45RA-, en terminaal gedifferentieerde effectorgeheugen T-cellen (T EMRA) als CD27– CD45RA+. CD19+ B-cellen kunnen worden onderverdeeld in populaties die CD27 versus IgD 6,7 tot expressie brengen, naïeve B-cellen drukken CD27n-geheugen tot expressie B-cellen (mBC’s) kunnen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van IgD6, en regulerende T-cellen (Tregs) kunnen worden geïdentificeerd als CD4 + CD25 ++ CD127laag 8. Om een gestandaardiseerd flowcytometrie-experiment op te zetten om de consistentie en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten in meerdere centra te bereiken, werd een snelle en haalbare standaardisatiemethode vastgesteld om de overdracht van protocollen over verschillende flowcytometers voor de detectie van lymfocyten in het volbloed van JE-gevaccineerde kinderen te vergemakkelijken. Zes gezonde kinderen (2 jaar oud) werden gerekruteerd uit het Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University. Na het ontvangen van een prime en boost vaccinatie met een levend verzwakt JE SA14-14-2 vaccin minder dan 6 maanden eerder, werden perifere bloedmonsters verzameld van de vrijwilligers. Zeer vergelijkbare gegevens werden verkregen uit verschillende instrumenten volgens gestandaardiseerde procedures, wat nuttig is voor multicenter-beoordelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunofenotypering van perifere bloedlymfocytensubgroepen kan helpen de veranderingen in celgemedieerde adaptieve immuniteit na vaccinatie bij kinderen te begrijpen. In klinische toepassingen doen zich onverwachte situaties voor, zoals het niet tijdig detecteren van monsters of het vervangen van een flowcytometer; Daarom zijn snelle gestandaardiseerde methoden nodig die overdrachten tussen flowcytometers in verschillende laboratoria vergemakkelijken 9,10,11.…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW werd ondersteund door Beijing Natural Science Foundation, China (nr. 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr. 82002130), XZ werd ondersteund door het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2019-I2M-5-026).
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
参考文献
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
