التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي
概要
تصف الطرق الحالية نهجا غير متناسب لتصوير الكالسيوم عالي الدقة وشبه المجزأ في الجسم الحي في Caenorhabditis elegans باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المتاحة بسهولة.
Abstract
تم استخدام تصوير الكالسيوم (Ca 2+) إلى حد كبير لفحص النشاط العصبي ، ولكن أصبح من الواضح بشكل متزايد أن معالجة Ca2+ تحت الخلوية هي عنصر حاسم في الإشارات داخل الخلايا. أثبت تصور ديناميكيات Ca2+ تحت الخلوية في الجسم الحي ، حيث يمكن دراسة الخلايا العصبية في دوائرها الأصلية السليمة ، أنه يمثل تحديا تقنيا في الأنظمة العصبية المعقدة. تتيح الشفافية والجهاز العصبي البسيط نسبيا للديدان الخيطية Caenorhabditis elegans التعبير الخاص بالخلية والتصور في الجسم الحي لعلامات ومؤشرات الفلورسنت. من بين هذه المؤشرات الفلورية التي تم تعديلها للاستخدام في السيتوبلازم وكذلك المقصورات تحت الخلوية المختلفة ، مثل الميتوكوندريا. يتيح هذا البروتوكول التصوير غير النسبي Ca 2+ في الجسم الحي بدقة تحت خلوية تسمح بتحليل ديناميكيات Ca2+ وصولا إلى مستوى العمود الفقري التغصني الفردي والميتوكوندريا. هنا ، يتم استخدام مؤشرين متاحين مشفرين وراثيا مع تقارب Ca 2+ مختلف لإثبات استخدام هذا البروتوكول لقياس مستويات Ca2+ النسبية داخل السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا في زوج واحد من الخلايا العصبية البينية المثيرة (AVA). جنبا إلى جنب مع التلاعب الجيني والملاحظات الطولية الممكنة في C. elegans ، قد يكون بروتوكول التصوير هذا مفيدا للإجابة على الأسئلة المتعلقة بكيفية تنظيم معالجة Ca2+ لوظيفة الخلايا العصبية واللدونة.
Introduction
أيونات الكالسيوم (Ca2+) هي ناقلات متعددة الاستخدامات للمعلومات في العديد من أنواع الخلايا. في الخلايا العصبية ، يكون Ca2+ مسؤولا عن إطلاق الناقلات العصبية المعتمدة على النشاط ، وتنظيم الحركة الهيكلية الخلوية ، وضبط عمليات التمثيل الغذائي ، بالإضافة إلى العديد من الآليات الأخرى اللازمة للصيانة العصبية المناسبة والوظيفة 1,2. لضمان الإشارات الفعالة داخل الخلايا ، يجب أن تحافظ الخلايا العصبية على مستويات منخفضة من الكالسيومالقاعدي 2+ في السيتوبلازم3. يتم تحقيق ذلك من خلال آليات معالجة Ca 2+ التعاونية ، بما في ذلك امتصاص Ca2+ في العضيات مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا. هذه العمليات ، بالإضافة إلى ترتيب القنوات الأيونية المنفذة للكالسيوم 2+ في غشاء البلازما ، تؤدي إلى مستويات غير متجانسة من السيتوبلازم Ca2+ في جميع أنحاء الخلايا العصبية.
يسمح عدم التجانس Ca 2+ أثناء الراحة والتنشيط العصبي بالتنظيم المتنوع والخاص بالموقع للآليات المعتمدة على Ca 2+ 1. أحد الأمثلة على التأثيرات الخاصة بالتركيز ل Ca 2+ هو إطلاق Ca 2+ من ER من خلال مستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). مطلوب مستويات منخفضة من الكالسيوم2+ بالاشتراك مع InsP3 لفتح مسام مستقبلات الكالسيوم القابلة للاختراق. بدلا من ذلك ، تمنع مستويات الكالسيوم2+ المرتفعة بشكل مباشر وغير مباشر المستقبل4. يتم دعم أهمية توازن Ca 2+ للوظيفة العصبية المناسبة من خلال الأدلة التي تشير إلى أن المعالجة والإشارات داخل الخلايا Ca2+ المعطلة هي خطوة مبكرة في التسبب في الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة الطبيعية 5,6. على وجه التحديد ، يرتبط امتصاص الكالسيوم2+ غير الطبيعي والإفراج عنه بواسطة ER والميتوكوندريا ببداية الخلل الوظيفي العصبي في مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون 6,7.
تتطلب دراسة خلل التشوب Ca 2+ أثناء الشيخوخة الطبيعية أو التنكس العصبي الملاحظة الطولية لمستويات Ca2+ مع دقة تحت خلوية في كائن حي سليم يتم فيه الحفاظ على البنية الخلوية الأصلية (أي ترتيب نقاط الاشتباك العصبي وتوزيع القنوات الأيونية). تحقيقا لهذه الغاية ، يوفر هذا البروتوكول إرشادات حول استخدام مستشعرين Ca 2+ متاحين بسهولة ومشفرين وراثيا لتسجيل ديناميكيات Ca2+ في الجسم الحي بدقة مكانية وزمانية عالية. توضح النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة الموصوفة في C. elegans كيف يمكن أن يسمح التعبير عن مؤشرات Ca 2+ في السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا للخلايا العصبية المفردة بالحصول السريع على صور الفلورسنت (حتى 50 هرتز) التي توضح ديناميكيات Ca 2+ مع القدرة الإضافية على تمييز مستويات Ca 2+ داخل هياكل تشبه العمود الفقري الفردي والميتوكوندريا الفردية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتضمن الاعتبار الأول عند تنفيذ الطريقة الموضحة اختيار مؤشر Ca2+ بخصائص مثالية لسؤال البحث المحدد. عادة ما يكون لمؤشرات Ca 2+ السيتوبلازمية تقارب كبير مع Ca 2+ ، وترتبط حساسية هذه المؤشرات تجاه Ca2+ عكسيا بالحركية (معدل التشغيل / الإيقاف)16,17. ?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01- NS115947 الممنوحة ل F. Hoerndli). نود أيضا أن نشكر الدكتور أتيلا ستيتاك على بلازميد pAS1.
Materials
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
参考文献
- Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
- Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
- Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
- Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
- Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer’s disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
- Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
- Ogama, T. A beginner’s guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
- Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
- Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
- de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
- Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
- Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
- Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
- Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
- Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
- O’Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
- Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
- Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
- Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
- Cho, J. -. H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
- Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
- Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
- Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).
