تصف الطرق الحالية نهجا غير متناسب لتصوير الكالسيوم عالي الدقة وشبه المجزأ في الجسم الحي في Caenorhabditis elegans باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المتاحة بسهولة.
تم استخدام تصوير الكالسيوم (Ca 2+) إلى حد كبير لفحص النشاط العصبي ، ولكن أصبح من الواضح بشكل متزايد أن معالجة Ca2+ تحت الخلوية هي عنصر حاسم في الإشارات داخل الخلايا. أثبت تصور ديناميكيات Ca2+ تحت الخلوية في الجسم الحي ، حيث يمكن دراسة الخلايا العصبية في دوائرها الأصلية السليمة ، أنه يمثل تحديا تقنيا في الأنظمة العصبية المعقدة. تتيح الشفافية والجهاز العصبي البسيط نسبيا للديدان الخيطية Caenorhabditis elegans التعبير الخاص بالخلية والتصور في الجسم الحي لعلامات ومؤشرات الفلورسنت. من بين هذه المؤشرات الفلورية التي تم تعديلها للاستخدام في السيتوبلازم وكذلك المقصورات تحت الخلوية المختلفة ، مثل الميتوكوندريا. يتيح هذا البروتوكول التصوير غير النسبي Ca 2+ في الجسم الحي بدقة تحت خلوية تسمح بتحليل ديناميكيات Ca2+ وصولا إلى مستوى العمود الفقري التغصني الفردي والميتوكوندريا. هنا ، يتم استخدام مؤشرين متاحين مشفرين وراثيا مع تقارب Ca 2+ مختلف لإثبات استخدام هذا البروتوكول لقياس مستويات Ca2+ النسبية داخل السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا في زوج واحد من الخلايا العصبية البينية المثيرة (AVA). جنبا إلى جنب مع التلاعب الجيني والملاحظات الطولية الممكنة في C. elegans ، قد يكون بروتوكول التصوير هذا مفيدا للإجابة على الأسئلة المتعلقة بكيفية تنظيم معالجة Ca2+ لوظيفة الخلايا العصبية واللدونة.
أيونات الكالسيوم (Ca2+) هي ناقلات متعددة الاستخدامات للمعلومات في العديد من أنواع الخلايا. في الخلايا العصبية ، يكون Ca2+ مسؤولا عن إطلاق الناقلات العصبية المعتمدة على النشاط ، وتنظيم الحركة الهيكلية الخلوية ، وضبط عمليات التمثيل الغذائي ، بالإضافة إلى العديد من الآليات الأخرى اللازمة للصيانة العصبية المناسبة والوظيفة 1,2. لضمان الإشارات الفعالة داخل الخلايا ، يجب أن تحافظ الخلايا العصبية على مستويات منخفضة من الكالسيومالقاعدي 2+ في السيتوبلازم3. يتم تحقيق ذلك من خلال آليات معالجة Ca 2+ التعاونية ، بما في ذلك امتصاص Ca2+ في العضيات مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا. هذه العمليات ، بالإضافة إلى ترتيب القنوات الأيونية المنفذة للكالسيوم 2+ في غشاء البلازما ، تؤدي إلى مستويات غير متجانسة من السيتوبلازم Ca2+ في جميع أنحاء الخلايا العصبية.
يسمح عدم التجانس Ca 2+ أثناء الراحة والتنشيط العصبي بالتنظيم المتنوع والخاص بالموقع للآليات المعتمدة على Ca 2+ 1. أحد الأمثلة على التأثيرات الخاصة بالتركيز ل Ca 2+ هو إطلاق Ca 2+ من ER من خلال مستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). مطلوب مستويات منخفضة من الكالسيوم2+ بالاشتراك مع InsP3 لفتح مسام مستقبلات الكالسيوم القابلة للاختراق. بدلا من ذلك ، تمنع مستويات الكالسيوم2+ المرتفعة بشكل مباشر وغير مباشر المستقبل4. يتم دعم أهمية توازن Ca 2+ للوظيفة العصبية المناسبة من خلال الأدلة التي تشير إلى أن المعالجة والإشارات داخل الخلايا Ca2+ المعطلة هي خطوة مبكرة في التسبب في الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة الطبيعية 5,6. على وجه التحديد ، يرتبط امتصاص الكالسيوم2+ غير الطبيعي والإفراج عنه بواسطة ER والميتوكوندريا ببداية الخلل الوظيفي العصبي في مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون 6,7.
تتطلب دراسة خلل التشوب Ca 2+ أثناء الشيخوخة الطبيعية أو التنكس العصبي الملاحظة الطولية لمستويات Ca2+ مع دقة تحت خلوية في كائن حي سليم يتم فيه الحفاظ على البنية الخلوية الأصلية (أي ترتيب نقاط الاشتباك العصبي وتوزيع القنوات الأيونية). تحقيقا لهذه الغاية ، يوفر هذا البروتوكول إرشادات حول استخدام مستشعرين Ca 2+ متاحين بسهولة ومشفرين وراثيا لتسجيل ديناميكيات Ca2+ في الجسم الحي بدقة مكانية وزمانية عالية. توضح النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة الموصوفة في C. elegans كيف يمكن أن يسمح التعبير عن مؤشرات Ca 2+ في السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا للخلايا العصبية المفردة بالحصول السريع على صور الفلورسنت (حتى 50 هرتز) التي توضح ديناميكيات Ca 2+ مع القدرة الإضافية على تمييز مستويات Ca 2+ داخل هياكل تشبه العمود الفقري الفردي والميتوكوندريا الفردية.
يتضمن الاعتبار الأول عند تنفيذ الطريقة الموضحة اختيار مؤشر Ca2+ بخصائص مثالية لسؤال البحث المحدد. عادة ما يكون لمؤشرات Ca 2+ السيتوبلازمية تقارب كبير مع Ca 2+ ، وترتبط حساسية هذه المؤشرات تجاه Ca2+ عكسيا بالحركية (معدل التشغيل / الإيقاف)16,17. ?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01- NS115947 الممنوحة ل F. Hoerndli). نود أيضا أن نشكر الدكتور أتيلا ستيتاك على بلازميد pAS1.
100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Version 1.52a | |
IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
pBSKS | Stratagene | ||
pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |