Ein gebrauchsfertiger gefrorener Vorrat an Neuronen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bewertung synaptischer Funktionen. Hier stellen wir eine einfache Primärkultur mit geringer Dichte aus gefrorenen Beständen unter Verwendung einer 96-Well-Platte vor.
Neuronale Kultur ist ein wertvolles System zur Bewertung synaptischer Funktionen und Medikamentenscreenings. Insbesondere eine Kultur mit geringer Dichte von primären Hippocampus-Neuronen ermöglicht die Untersuchung einzelner Neuronen oder subzellulärer Komponenten. Wir haben die Lokalisierung subzellulärer Proteine innerhalb eines Neurons durch Immunzytochemie, neuronale Polarität, synaptische Morphologie und ihre Entwicklungsänderung unter Verwendung einer primären Hippocampuskultur mit niedriger Dichte gezeigt. In jüngster Zeit sind gebrauchsfertige gefrorene Bestände von Neuronen kommerziell verfügbar geworden. Diese gefrorenen Neuronenbestände verkürzen den Zeitaufwand für die Vorbereitung von Tierversuchen und tragen auch dazu bei, die Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren. Hier stellen wir eine reproduzierbare Primärkulturmethode mit niedriger Dichte unter Verwendung einer 96-Well-Platte vor. Wir verwendeten einen kommerziell erhältlichen gefrorenen Vorrat an Neuronen aus dem embryonalen Hippocampus der Ratte. Die Neuronen können langfristig ohne Medienveränderungen stabil kultiviert werden, indem das Wachstum von Gliazellen zu bestimmten Zeitpunkten reduziert wird. Dieser Hochdurchsatz-Assay mit Low-Density-Kultur ermöglicht reproduzierbare bildgebende Auswertungen der synaptischen Plastizität.
Die Entwicklung eines experimentellen In-vitro-Systems, das synaptische Funktionen beurteilen kann, die an Lernen und Gedächtnis beteiligt sind, ist wichtig. Neuronale Kultur ist ein wertvolles System zur Bewertung synaptischer Funktionen in vitro. Die neuronale Kulturtechnik wurde erstmals in den 1980er Jahren eingesetzt, und in den 1990er Jahren wurde eine Low-Density-Kultur von primären Hippocampus-Neuronen entwickelt 1,2,3 für die Untersuchung einzelner Neuronen in Bezug auf subzelluläre Lokalisation von Proteinkomponenten, Proteintransport, neuronale Polarität, Wirbelsäulenmorphologie, Synapsenentwicklung und Plastizität 4,5,6,7,8 . Bei dieser Technik sind jedoch viele Schritte erforderlich: Paarung der Tiere, Sezieren von Embryonen, Vorbereiten von Kulturgefäßen und Kultivieren von Zellen für 3 Wochen mit Medienwechsel einmal pro Woche. Darüber hinaus erfordert es fortgeschrittene Techniken3.
Wir haben gefrorene Bestände von dissoziierten Hippocampus-Neuronen aus Rattenembryonen 9,10 entwickelt. Die gefrorenen Neuronenvorräte sind gebrauchsfertig, und es sind keine fortgeschrittenen Techniken erforderlich, um die Zellen zu kultivieren11,12. Mit anderen Worten, die Kultivierung der Neuronen aus gefrorenen Beständen hängt nicht von der Technik eines Experimentators ab. Es macht Tierversuche überflüssig (z. B. Genehmigung von Tierversuchen, Vermittlung von zeitlich begrenzten trächtigen Tieren und Sezieren von Rattenembryonen), wodurch die Anzahl der verwendeten Tiere reduziert wird. In jüngster Zeit sind hochwertige, gebrauchsfertige gefrorene Bestände von Neuronen kommerziell verfügbar geworden. Hier verwendeten wir handelsübliche Tiefkühlbestände aus dem embryonalen Tag (E) 18 Rattenhippocampus13,14,15. Die Kultivierung der Neuronen aus einem gefrorenen Stamm erfordert keine glia-konditionierten Medien oder Co-Kultur mit Gliazellen. Gewöhnliche Primärkulturmedien ohne zusätzliches Serum können zur Kultivierung der Zellen verwendet werden; So können wir reproduzierbare Daten gewinnen. Darüber hinaus ist für 3 Wochen nach der Zellaussaat kein Medienaustausch erforderlich, da das Wachstum von Gliazellen reduziert ist (Abbildung 1).
Dendritische Dornen sind das postsynaptische Kompartiment der meisten erregenden Synapsen. Sie enthalten Rezeptorproteine, postsynaptische Gerüstproteine und Aktin-Zytoskelettproteine. Wir konzentrierten uns auf ein Aktin-bindendes ProteinDrebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin reichert sich am Wirbelsäulenkopf in reifen Neuronenan 19, und wir berichteten über Drebrin als Marker für den synaptischen Zustand 15,17,20,21,22,23. Durch die Durchführung einer High-Content-Analyse mit Drebrin als Auslese haben wir kürzlich über die hemmenden Wirkungen von Phencyclidin-Analoga auf N-Methyl-D-Asparaginsäure-Glutamatrezeptoren (NMDARs)10 und die NMDAR-abhängigen Wirkungen von natürlichen Verbindungen und rohen Arzneimitteln auf synaptische Zustände berichtet15.
Hier beschreiben wir, wie gefrorene Bestände von Neuronen mit geringer Dichte kultiviert werden können. Darüber hinaus zeigen wir eine Drebrin-Imaging-basierte Bewertung des synaptischen Zustands unter Verwendung von 96-Well-Platten.
Ein kritischer Schritt bei dieser Methode ist das Auftauen der Zellsuspension. Der Transfer der Zellsuspension, bevor es zu warm wird, ist sehr wichtig. Um den schnellen Wechsel der Osmolalität zu vermeiden, sollte die Zellsuspension jedoch nicht auf einmal auf ein großes Volumen des Mediums übertragen werden. Die tropfenweise Zugabe des Nährmediums ist ebenfalls entscheidend, um plötzliche Änderungen des osmotischen Drucks zu vermeiden.
Die Neuronen können in anderen Kulturgefäßen kultiviert werden: 24-Well-Platten, 8-Well-Kammern, 60-mm-Schalen oder MED-Sonden. In diesen Fällen müssen jedoch die Endkonzentration und der Zeitpunkt der Zugabe von Ara-C angepasst werden. Darüber hinaus muss die Dichte der Neuronen in verschiedenen Arten von Experimenten optimiert werden. Zum Beispiel ist für elektrophysiologische Experimente eine Kultur mit hoher Dichte erforderlich, und in diesem Fall ist der Medienaustausch zweimal pro Woche erforderlich (Abbildung 6). Daher erfordert eine Kultur mit geringer Dichte weniger Schritte als eine Kultur mit hoher Dichte.
Neuronale Kulturen mit geringer Dichte erfordern oft fortschrittliche Techniken. Die Verwendung von gebrauchsfertiger Tiefkühlware löst dieses Problem jedoch. Die beschriebene Methode hängt nicht von den Fähigkeiten eines Experimentators ab. Die Qualität der Tiefkühlware ist stabil und kann stabil kultiviert werden, solange sie in flüssigem Stickstoff gelagert werden und Temperaturschwankungen für bis zu 4 Jahre vermieden werden.
Die Kultivierung der Zellen über 3 Wochen ohne Mediumsaustausch wirft die Frage auf, ob es zu signifikanten Osmolalitätsänderungen oder Nährmedienverdunstung kommt. Wir haben jedoch bestätigt, dass die Verdunstung von Nährmedien gering ist (Reduktionsrate von 3,6%). Die Lokalisation der synaptischen Proteine und die Morphologie der Neuronen erscheinen nach 3 Wochen normal. Daher verursacht eine 3-wöchige Kultur ohne Medienaustausch keine großen Osmolalitätsänderungen, die sich auf die Bedingungen der kultivierten Neuronen auswirken. Die Aufbewahrung der Platte in einem Inkubator nach der Ara-C-Behandlung ist ebenfalls ein wichtiger Punkt, der die Verdunstung minimiert.
Es gibt keine Einschränkung in Bezug auf die Verwendung der gefrorenen Stammneuronen. Es gibt jedoch einige Einschränkungen der Low-Density-Kulturmethode. Wir bestätigten, dass die Low-Density-Kultur für die morphologische Beobachtung von Neuronen, die Bewertung der synaptischen Funktion und die GFP-Transfektion eingesetzt werden kann. Wir haben jedoch die Bildgebung von lebenden Zellen nicht untersucht. Darüber hinaus ist, wie oben erwähnt, eine Kultur mit hoher Dichte erforderlich, um die Elektrophysiologie durchzuführen.
Die Synapsenreifung dauert in der Regel 3 Wochen7, und wir können bis zum Ende nicht bestätigen, dass die kultivierten Neuronen richtige Synapsen haben. Wenn die Synapsenreifung nach 3 Wochen nicht gut ist, müssten wir wieder kultivieren. Indem wir die Qualität der Neuronen kennen, bevor wir mit den Experimenten beginnen, können wir diese 3 Wochen sparen. Um Experimente effizient durchführen zu können, ist es daher am besten, die Qualität der Neuronen im Voraus zu überprüfen. Gefrorene Bestände ermöglichen es, die Qualität der Neuronen im Vorfeld zu überprüfen. Jede Charge von Tiefkühlbeständen wird aus einem Wurf Ratten erzeugt, und wir können einen der Bestände aus jeder Charge für eine Qualitätskontrolle verwenden. Drebrin ist ein guter Marker für die Qualitätskontrolle der Neuronen. Wie beschrieben, reichert sich Drebrin im Wirbelsäulenkopf in reifen Neuronen an und reagiert auf synaptische Stimulation. So können wir die Qualität der Neuronen in Tiefkühlbeständen überprüfen, indem wir Drebrin als Marker verwenden.
Diese Methode kann angewendet werden, um die Wirkung von Medikamenten auf den synaptischen Zustand zu bewerten. Der Drebrin-Exodus aus dendritischen Dornen tritt in den Anfangsstadien der synaptischen Plastizitätauf 22. Daher zeigt der Nachweis einer Drebrin-Cluster-Reduktion, die durch eine medikamentöse Behandlung hervorgerufen wird, dass das Medikament die Synapse stimuliert und synaptische Plastizität verursacht. Um festzustellen, ob die Reduktion NMDAR-abhängig ist, ist ein Experiment mit 2-Amino-5-Phosphonovaleriansäure (APV, ein NMDAR-Antagonist) nützlich. Mit Drebrin als Marker wird sogar eine NMDAR-Abhängigkeit eindeutig festgestellt10,15. Die beschriebene Methode ist nützlich bei Arzneimittel-Screenings, sicherheitspharmakologischen Studien und der Bewertung der synaptischen Funktion.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Kazumi Kamiyama und Manami Kawada für die Unterstützung bei den Experimenten. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Fördernummer 19K08010 an N.K.) und Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (Fördernummer JP19bk0104077 und JP22bm0804024 an T.S.) unterstützt.
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |