根癌农杆菌介导的窄叶车前草遗传转化

注意：步骤1.4-1.8，2.3-2.5，3.3-3.6，4.1-4.6，5.1-5.7和6.1-6.3必须在无菌条件下进行，使用干净的罩以防止污染。 1. 植物材料繁殖转化 根据所需植物的数量，将市售野生型（WT）车 前草 种子（见 材料表）放入50 mL离心管中，直至5 mL线。注意：或者，当需要少量种子时，可以使用2 mL微量离心管，但应将其填充至不超过0.1 mL的体积，因为种子过多会降低灭菌效率。 将种子浸泡在75%乙醇中60秒。 丢弃乙醇，然后将种子浸入20%次氯酸钠（20%NaClO，80%无菌水）中40分钟，轻轻倒置管，使所有种子与溶液接触。注意：次氯酸钠溶液必须新鲜制作以获得最佳效果。 在层流罩下，弃去次氯酸钠溶液，然后用蒸馏水（五次）洗涤种子。最后一次冲洗后，在种子中加入少量水，因为这有助于植物移动到盘子上。 使用灭菌的镊子，将种子转移到带有固体MS培养基的预先制备的95 mm x 100 mm培养皿上（表1）。将种子均匀地散布在板的表面上，每个种子之间约1厘米，以防止发芽的幼苗过度拥挤（图1A）。 用两层石蜡膜密封板以防止污染，然后在室温（22°C，50μmolm-2 s-1，12小时天）下在冷白色生长灯（见材料表）下孵育。种子通常在5-6天内发芽。 当幼苗发芽并且足够大以转移时（图1B），通常在发芽后2或3天，使用灭菌的镊子将幼苗转移到装有50-100mLMS培养基的无菌盒中（表1）。理想情况下，每箱只种植五棵幼苗，以获得最优质的根。 用手术胶带密封盒子，然后让植物在冷白色生长灯下生长（见 材料表），条件与步骤1.6中提到的相同。植物应该在大约 3-4 周内准备好转化，或者当主根长约 2 厘米长并且侧根呈白色时。注意：培养基制备配方和维生素储备包含在表 1 和 表2中。 2. 质粒构建与 大肠杆菌 转化 注意：确切的质粒构建程序因目的基因而异。在此过程中，使用标准克隆程序20，使用限制性内切酶HindIII和SalII将1.5kb AtPP2启动子插入带有GUS的二元质粒pBI101（参见材料表）中。AtPP2（韧皮部蛋白2）是一种在韧皮部21中特异性表达的基因。 使用来自 拟南芥的引物对5′-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3’（向前）和5′-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTTTTTG-3’（反向）克隆启动子。 图2 显示了带有 AtPP2：GUS 插入片段的二元质粒载体图。 质粒构建后，使用热休克方法22将质粒转化为DH5a大肠杆菌（参见材料表）感受态细胞，然后在37°C振荡（150rpm）孵育1.5小时。 取150μL每种转化培养物，以适当的选择（50mg / L卡那霉素用于本协议中使用的菌株;参见材料表）板到LB琼脂培养基平板（表1）上，然后将平板在37°C孵育16-24小时。注意：本研究中使用的细菌菌株是 A. tumefaciens GV3101。 接下来，使用菌落PCR筛选菌落中的阳性重组体23。注意：在该协议中，以下引物用于扩增目标基因;5′-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3’（向前）和5′-TCATTGTTTGCCTCTCTCGCTGC-3’（反向）。在热循环仪（参见 材料表）中以95°C下3分钟的循环条件运行反应，然后进行35个循环：95°C下30秒，55°C下30秒，72°C下2分钟，最后10分钟伸长步骤在72°C。 用适当的抗生素（50mg / L卡那霉素）接种6mLLB肉汤（表1）中的阳性菌落，并在37°C下以200-250rpm生长过夜。 过夜生长后，使用标准程序从细菌中提取质粒24。 3. 根癌杆菌 质粒转化 质粒提取后，使用电穿孔将修饰的质粒转化为所需的感受态细胞菌株。在此过程中，使用 根癌农 杆菌菌株GV3101。遵循电穿孔技术的标准化方法25. 电穿孔后，将感受态细胞重悬于1mLLB肉汤中，然后在28°C以100rpm孵育2-4小时。 通过在室温（22°C）下在台式微量离心机（参见材料表）中以6，800×g离心3分钟收集细胞，然后将50-100μL散布到具有适当选择剂的LB琼脂平板上（本协议中使用的质粒为50mg / L卡那霉素）。 细胞在28°C孵育2天后，通过使用集落PCR鉴定含有目的基因的阳性菌落。在此协议中，使用步骤2.4中提到的引物和条件。 接下来，使用阳性菌落用LB琼脂培养基+选择划线储备板。该板可在4°C下储存长达1个月。 或者，对于长期储存，用少量LB接种阳性菌落，并进行适当的选择。将接种的培养物在28°C以200rpm振荡过夜，然后制备甘油储备液（50%w / v甘油在细菌和甘油的50：50混合物中），可在-80°C下储存长达10年。 4. 根癌A. 准备 使用适当的选择剂将含有所需质粒的根 癌农杆菌 划线到制备的95 mm x 100 mm实心LB板上。在该协议中，使用带有质粒插入片段 AtPP2：GUS 的细菌菌株GV3101，并添加50mg / L卡那霉素进行选择。 用石蜡膜密封板，然后在28°C下孵育长达48小时，或直到细菌长到足够大以进行采摘。 在转化前 2 天使用移液器吸头挑选细菌菌落，并将其接种在含有 6 mL 液体 LB 的 15 mL 圆底管中，并进行适当的选择。在28°C台式摇床中以200rpm摇晃过夜，直到OD600 达到0.6-0.7。注意：板和6 mL细菌接种物可以在4°C下储存长达1个月。 当细菌达到正确的OD600时，使用移液管将 根癌曲霉 转移到含有100mL液体LB的无菌烧瓶中，并带有选择剂。通常，每 100 mL LB 含有 200 μL 细菌适合繁殖。在28°C下以200rpm摇匀过夜，直到OD600 达到0.6-0.7。 将细菌转移到50mL无菌离心管中，并在室温（22°C）下在台式离心机中以2， 200xg 离心10分钟以收集细菌。 使用移液管弃去上清液。通过移液将细菌沉淀重悬于5 mL室温（22°C）液体悬浮溶液（SS）（表1）中，然后加入至50 mL SS并倒置数次混合。细菌现在已经准备好转化了。注意：液体SS必须在转化后1周内新鲜制备。注意：所有与 根癌曲霉 接触的材料都需要丢弃在生物危害废物箱中。细菌培养物中剩余的液体可以用浓度为20%或更高的次氯酸钠（漂白剂）灭菌。 5. 车前子 根的转化 当植物达到理想的转化阶段（幼苗3周龄）（图1C）时，使用无菌镊子和剪刀将根与植物的其余部分分开（图3A）。丢弃叶子和茎材料。 切割后，立即使用无菌镊子将根片转移到装有无菌水的无菌盒中。此步骤允许根部在收集所有组织时保持水分。 当所有根都被切断时，将 根癌农杆菌/ SS悬浮液倒入无菌的150 mm x 15 mm一次性培养皿中。将根转移到 根癌农 杆菌培养物中并接种至少20分钟（图3B）。 在孵育过程中，使用带有锋利刀片的无菌手术刀将根切成1厘米的碎片，将主根与侧根分开。在根部表面做薄而浅的切口，让细菌感染植物。注意：如果处理大量植物，请将根部分批转移到细菌培养物中，以确保在接种过程中所有根部都浸入其中。 孵育后，使用无菌镊子将根片转移到无菌纸巾上以去除多余的细菌。避免干燥根部超过60秒，因为这会导致脱水并损坏根组织。理想情况下，可以同时干燥10-15个根（图3C）。 将干燥的根转移到具有固体共培养基的制备的95mm x 15mm培养皿中（表1），每个板约10-20根，具体取决于根的大小（图3D）。 用两层透明塑料薄膜密封板，然后用铝箔覆盖。在室温（22°C）下孵育3天。此步骤为细菌在没有抗生素选择的情况下感染根部提供了时间（图3E）。 6. 选择和全株再生 在共培养基中孵育后，将根块转移到制备的95 mm x 15 mm培养皿中，培养皿中含有固体芽诱导培养基（SIM）（表1）和Timentin（500mg / L;参见 材料表）和适当的抗生素选择。在该方案中，我们使用卡那霉素（100mg / L）。注意：根部的底部必须与介质完全接触。不接触培养基表面的根太长，必须切割以防止组织逃脱选择。 用两层透明塑料薄膜密封板，然后在生长灯下生长1个月（有关适当的条件，请参见步骤1.6），或直到芽开始出现。注意：通常，在生长2周后可以观察到芽首字母，并且通常在1个月后可以看到芽。 当小苗长1.5-2.0厘米时（图1D），将它们转移到带有固体根诱导培养基的准备好的无菌盒中（表1）。 在生长灯下种植植物（条件见步骤1.6）数周，直到根形成。根通常可以在 1 周后首次看到。注意：建议在移动到土壤之前让根部生长数周，因为根系较大的植物在土壤中的存活率往往更高。 7. 土壤转移 当根系变得足够大以转移时（图1E），通常在生长1个月后，将植物转移到含有预润湿通用土壤（BM7）的3.5个方形花盆中。在该协议中，使用了BM7树皮混合物（见 材料表）。用水轻轻清洗，去除任何粘在根部的介质。注意：植物可以在800至1400μmol光子m-2 s-2的温室中使用600W高钠压力灯（见材料表）在温室中生长至成熟，或在室温（22°C）的生长室中以50μmol m-2 s-1的冷白光生长至成熟，12小时天。 用塑料盆盖盖住植物，然后用透明塑料袋盖住它们。这一步允许植物在适应土壤时保持在潮湿的环境中。 大约3-5天后，取下塑料袋，然后慢慢取下盖子，以适应外部环境。注意：根据一年中的时间和植物转移到的环境，植物需要适应的时间可能会有所不同。建议每天检查植物，并根据需要向花盆加水。 定期给植物浇水，并根据需要添加肥料。植物也可以转移到更大的花盆中以进一步生长（图1F）。 8. β-葡糖醛酸酶（GUS）组织化学染色 根据已发布的方案制备β-葡糖醛酸酶（GUS）染色溶液15。 当芽首字母长约 0.5-1 厘米时，取出完全展开的年轻叶子的一个小尖端（<5 毫米长度通常就足够了），并立即转移到 1.5 或 2 mL 微量离心管中的 0.5-1 mL GUS 染色溶液中。溶液应完全覆盖植物组织。 将打开的管放入真空干燥器中，并以20-25kPa真空5-10分钟。在真空过程中，溶液中应可见小气泡。这允许溶液进入植物的细胞。 让空气过滤回真空干燥器。关闭试管并在37°C孵育过夜（12小时），或直到蓝色可见。注意：在这项研究中，GUS活性局限于韧皮部，这意味着在积极转化的植物中，蓝色染色应该只在韧皮部组织中可见。没有转基因的植物不会经历染色（图4）。 为了更好地观察污渍，将植物转移到100%乙醇中以去除叶绿素。为了提高叶绿素去除过程的效率，将管在60°C孵育10分钟。注意：在去除所有叶绿素之前，可能需要多次更换乙醇，具体取决于被染色的叶子的大小。