Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

Las proteínas fluorescentes han surgido como herramientas poderosas para visualizar la localización de proteínas, la dinámica y las interacciones proteína-proteína en células dentro de organismos vivos ^1,2. El marcaje de genes endógenos con proteínas fluorescentes permite obtener imágenes en vivo a largo plazo de los procesos celulares con resolución subcelular. Además, estas técnicas de marcaje de genes endógenos tienen varias ventajas en comparación con los enfoques de sobreexpresión e inmunotinción. Por ejemplo, la sobreexpresión de proteínas puede conducir a un mal plegamiento de proteínas, interacciones inespecíficas proteína-proteína y mala localización³. Hasta la fecha, los investigadores han sido capaces de crear vastas bibliotecas de genes endógenos fusionados con proteínas fluorescentes para unos pocos organismos modelo, como la levadura en ciernes, que puede someterse a una^{recombinación} homóloga eficiente. En el caso de Drosophila melanogaster, se han ideado varias herramientas como MiMICs⁵, trampas potenciadoras^basadas en transposones 6 y fosmids⁷ para marcar genes de forma fluorescente.

El desarrollo de herramientas basadas en CRISPR-Cas9 ha hecho posible realizar de manera eficiente la edición del genoma, incluido el etiquetado de proteínas endógenas, en una amplia gama de organismos modelo ^8,9. Cas9 es una enzima guiada por ARN que escinde el ADN bicatenario de una manera altamente eficiente y específica⁸, que luego puede ser reparado por una vía de unión de extremos no homóloga (NHEJ) que conduce a mutaciones puntuales o deleciones. Alternativamente, la vía de reparación dirigida por homología (HDR) permite la integración del ADN heterólogo en el cromosoma.

Los métodos anteriores para el etiquetado de genes basado en CRISPR en el organismo modelo, Drosophila melanogaster, se han basado en un proceso de dos pasos 10,11,12. Esto implica el uso de un marcador de color de ojos discernible, Dsred, para detectar eventos HDR exitosos. Posteriormente, el marcador Dsred se extirparía mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. Para agilizar y agilizar este proceso, aquí te presentamos un método más sencillo y eficiente. Este enfoque evita la necesidad de genotipado letal y permite la detección directa de moscas individuales. Específicamente, empleamos un enfoque basado en PCR para extraer ADN de un pequeño segmento de la pata media de la mosca, lo que nos permite genotipar moscas individuales. Cabe destacar que este procedimiento no compromete la vitalidad, el movimiento o las capacidades reproductivas de la mosca muestreada. Solo los individuos apropiados, identificados a través de este método, se convierten en poblaciones estables.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para generar moscas marcadas con proteínas fluorescentes en el que los genes endógenos se marcan con reporteros fluorescentes. Esta técnica utiliza la edición del genoma CRISPR-Cas9 para fusionar cualquier etiqueta de fluoróforo deseada con el terminal N o C de un gen endógeno. A continuación, describimos el diseño y la construcción de plásmidos de ARNg y un plásmido de donante, la estrategia de cribado de un solo paso para seleccionar moscas positivas para CRISPR y los pasos para establecer líneas estables. Específicamente, describimos estrategias para marcar un gen endógeno de Drosophila, punto, con un fluoróforo en el terminal C. También describimos brevemente los experimentos de control que deben realizarse para confirmar que la proteína marcada es funcional y las técnicas de imagen en vivo para visualizar la proteína Period en neuronas de reloj vivo dentro de cerebros intactos de Drosophila ¹³. El protocolo descrito aquí también es ampliamente aplicable a los candidatos para la deleción e inserción de fragmentos específicos de ADN mediante la edición del genoma CRISPR-Cas9.