최소 침습 기술을 기반으로 한 마우스 타박상 척수 손상 모델 설정

참고 : 모든 실험은 산동 대학교 Cheeloo College of Medicine의 실험 동물 윤리 및 복지위원회 (승인 번호 : 21L60)의 승인을 받았으며 국립 보건원에서 발행 한 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 1996)에 따라 수행되었습니다. 1. 척수 손상 동축 플랫폼 및 기계적 테스트의 메커니즘 수술대, 척추 안정기 및 임팩터 팁으로 플랫폼을 조립합니다(그림 1).알림: 중량 강하 또는 슬리브의 먼지가 플랫폼의 정밀도에 영향을 미칠 수 있으므로 중량이 기류에 부딪히는 것을 방지하는 중량 강하 및 배기 슬롯을 깨끗하게 유지하십시오. 정확한 척수 위치를 확인할 수 있는 팁을 소매에 넣습니다. 경증, 중등도 및 중증 그룹에 대해 각각 1.3g, 2.0g 및 2.7g인 실험을 위한 체중 강하의 적절한 질량을 선택합니다. 당김 핀을 무게 방울의 구멍에 꽂습니다. X-Y-Z 암의 홈에 장착된 당김 핀을 사용하여 무게 강하를 슬리브 상단에 조립하여 위치 지정이 완료되면 무게가 해제되어 임팩터 팁에 부딪혀 결과적으로 척수가 손상되고 척수의 변화가 현미경으로 관찰됩니다. 작업자의 편의를 위해 탈착식 0.1mm 정밀 X-Y-Z 암을 조정하여 적절한 작업 공간을 제공합니다(그림 1D, E).알림: 연구 결과의 일관성을 확인하려면 실험을 시작하기 전에 피크 압력 감지 장치를 사용하여 무게를 슬리브 내부에 떨어 뜨릴 때 발생하는 힘을 측정하십시오. 향후 연구를 위해 확인을 반복 할 필요는 없습니다. 장치를 켜고 금속 압력 수용체를 팁 아래에 놓고 어댑터를 영점으로 조정하고 당김 핀을 풀고 실제 충격력을 기록합니다. 2. 제9 흉추 (T9)의 위치 및 후궁 절제술 참고: 암컷 C57BL/6J 마우스는 9-10주령의 지난 Pengyue 실험 동물 회사(Jinan, China)로부터 구입하였다. 실험을위한 수술 도구 제품군을 오토 클레이브하고 수술 전에 75 % 알코올로 수술대를 멸균하십시오. 부상 수술을 위해 마취하기 30 분 전에 진통 (0.05-2.0 mg / kg, SQ)을 위해 부 프레 노르 핀을 주사하십시오. 그런 다음 마우스를 이소 플루 란 (유도 : ~ 3 % -5 %, 유지 : ~ 1.5 % -2 %)으로 마취시킵니다. 동물이 꼬리 또는 발가락 꼬집음의 반사 신경에 의해 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 마취가 이루어지면 수술대의 지정된 부분에 마우스를 엎드린 자세로 놓고 각막을 안과 연고로 코팅하십시오 (수술 중 눈이 건조하지 않도록 각막에 안과 연고를 바르십시오).흉요추 위의 전기 면도기로 꼬리에서 주둥이까지 머리카락을 면도하십시오. iodophor로 30 초 동안 원을 그리며 피부를 여러 번 소독 한 다음 75 % 알코올을 멸균하십시오. 멸균 수술 드레이프를 바르고 메스와 칼날로 약 T6에서 T13까지 피부에 약 1.5cm의 세로 절개를합니다.참고: 늑골 가장자리를 따라 T12-T13 척추 간 공간이 있는 정중선까지 촉진합니다. 주둥이를 1.5cm 절개하고 절개는 T6-T13 척추와 대략 같은 높이입니다. 수술 현미경으로 뼈 부분에서 한쪽의 13번째 갈비뼈를 탐색합니다. 늑골 척추 각도의 영역을 가볍게 만진 다음 주둥이를 향해 T12-T13의 척추 간 공간을 찾아 정중선의 가시 돌기를 탐색합니다. T12-T13의 공간에서 쪽까지 T9-T10의 척추 간 공간을 탐색하십시오. (그림 2A, 3A) T9의 가시 돌기를 따라 척추 주위 근육을 마이크로 가위로 양쪽의 전방 및 후방 후면 관절로 해부합니다 (그림 3B). 마이크로 견인기로 척추 주위 근육을 수축시키고 마이크로 가위로 얇은 판과 T8-T9 및 T9-T10의 척추 간 공간에서 연조직을 청소하십시오. T9 후궁 절제술을 시행하고 미세 수술 겸자로 T9의 가시 돌기를 고정하고 약간 들어 올린 다음 척수 손상을 피하고 척수 손상을 피하고 미세 가위로 얇은 판을 잘라냅니다. 왼쪽에서 반복하면 척수가 노출 될 수 있습니다 (그림 2B, 3C). 척추를 고정하기 전에 보편적 인 팔을 풀고 척추 안정기의 미세 모기 집게로 척추 양쪽의 9-10 번째 패싯 관절을 천천히 고정하십시오. 마이크로 모기 집게의 나사를 조이면 척추가 안정화됩니다. 척수를 수평면으로 조정하고 유니버설 암을 조이면 척추가 고정됩니다 (그림 3D). 3. T9 타박상 부상 T9 수준의 척수가 노출되고 척추가 고정되면 수술 현미경 아래의 슬리브 안쪽 팁으로 척수를 겨냥합니다 (그림 3E). 현미경으로 척수와 팁의 관계를 쉽게 관찰 할 수 있고 수술대를 쉽게 돌릴 수 있기 때문에 팁의 표면이 척수의 뒤쪽 및 측면 측면에서 척수와 평행한지 확인하십시오. 척수와 평행 한 자연 기준면이므로 후궁 절제술 후 팁이 척수와 접촉하기 전에 팁의 표면이 여분의 층의 양측 경계와 평행한지 확인하십시오. T12-T13의 척추 간 공간을 찾은 후 임팩터의 끝이 관찰 창의 표시와 일치하고 지정된 높이 22mm에 도달할 때까지 슬리브를 내립니다. 당김 핀을 당겨 무게를 해제합니다(그룹에 따라 1.3g, 2.0g 또는 2.7g, 각 그룹에는 3마리의 마우스가 포함되고 각 그룹에는 각 시점마다 1마리의 마우스가 있음).알림: 척수는지면과 평행하고 팁에 수직이어야합니다. 테이블이 매우 컴팩트하기 때문에 미세한 시야를 확보하기 위해 수술대를 이동하십시오. 타박상이 끝나면 임팩터를 제거하고 작동 현미경으로 SCI의 정도를 관찰하십시오. 온화한 그룹에서는 밝은 붉은 색 변화가 보이는 반면, 중간 그룹에서는 부상 부위가 3-4 초 안에 진한 빨간색을 나타내며 아마도 탁월함이 관찰 될 수 있습니다. 심한 그룹에서는 진한 빨간색 증상이 즉시 나타날 수 있으며 경막에서 명백한 탁월함이 나타나지만 경막은 여전히 일관된 모양입니다 (그림 3F). 표면 근막과 피부를 봉합사로 봉합합니다 (폴리 프로필렌 비 흡수성 봉합사, 크기 : 6-0). 봉합을 마친 후 수술 부위를 소독하고 완전한 의식이 회복 될 때까지 마우스를 온도 조절 패드에 놓은 다음 마우스를 마우스 케이지에 넣습니다. 4. 동물 관리 회복을 위해 동물을 가열 패드에 놓고 양쪽 뒷다리의 움직임을 관찰하십시오.알림: 수술을받은 동물은 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌려 보내서는 안됩니다. 동물들이 음식에 쉽게 닿을 수 있도록 새장 바닥에 고수위를 섭취하십시오. 또는 먹이 테이블이 낮은 케이지를 사용하십시오. 중등도 및 중증 부상 그룹이 방광 기능을 회복하기 어렵 기 때문에 수술 후 하루에 두 번 마우스의 방광을 비우십시오. 진통제를 위해 부 프레 노르 핀 (0.05-2.0 mg / kg, SQ) 8-12 시간 / 일을 3 일 동안 주사하십시오. 5. 심경 관류, 염색 및 면역 염색 부상 후 1 일, 28 일 및 56 일에 각 그룹의 마우스를 관류로 각각 한 마리씩 희생하십시오.과도한 마취 후 60mL의 인산염 완충 식염수(PBS)와 20mL의 4% 파라포름알데히드(4%-6% 이소플루란)로 마우스를 관류합니다. 병변 중심에서 각각 주둥이와 꼬리로 1cm 연장되는 마이크로 가위로 척추를 모으십시오. 과도한 근육을 절제하고 5.1.4단계에서 기구가 고정할 수 있도록 부분 갈비뼈가 있는 손상되지 않은 척추 부분을 예약하고 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담그십시오. 고정을 위해 지혈 겸자로 갈비뼈를 고정하고 절제 된 층과 척수 병변 중심의 색 변화에 따라 현미경으로 병변 중심을 정의하십시오. 꼬리에서 마이크로 가위로 모든 층과 관절 과정을 절제하십시오. 마이크로 가위로 신경 뿌리를 잘라 내고 척수를 꺼냅니다. 마이크로 가위로 병변 센터에서 꼬리와 주둥이로 각각 연장되는 척수 0.5cm를 수집합니다. 척수를 4 ° C에서 48 시간 동안 30 % 자당에 넣습니다. 조직 검사 유형에 따라 동결 후 조직을 6μm 두께의 섹션으로 자릅니다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행합니다.섹션을 실온으로 다시 데우고 6μm 두께의 섹션을 4% 포름알데히드에 약 15분 동안 담근 다음 1x PBS에 1분 동안 4회 담가 잔류 OCT를 제거합니다. 헤 마톡 실린으로 섹션을 90 초 동안 염색하고 이중 증류수로 헹굽니다. 그런 다음 흐르는 물로 3 분 동안 섹션을 씻으십시오. 에오신으로 4분 동안 염색하고 95% 알코올에 30초 동안 두 번 담가 과도한 에오신을 헹굽니다. 마지막으로 그라데이션 알코올(95% 알코올 및 50% 알코올 한 번, 연속적으로)로 30초 동안 탈수하고 투명도를 위해 크실렌에 2분 동안 담근다. 그런 다음 시편을 수지 겔로 밀봉합니다(관상 평면 섹션: 그림 4, 시상면 섹션: 그림 5). 면역 형광 염색을 수행하십시오.섹션을 실온으로 다시 데우고 6μm 두께의 섹션을 4% 포름알데히드에 약 2분 동안 담근다. TBST에서 섹션을 5 분 동안 3 번 씻으십시오. 절편을 블로킹 용액 (PBS 중 10 % 염소 정상 혈청)으로 배양하고 1 시간 동안 차단하여 면역 글로불린의 비특이적 결합을 차단합니다. 척수 절편을 4°C에서 밤새 배양하여 마우스 항아교세포섬유소 산성 단백질(GFAP, 반응성 성상교세포 마커), 다클론 항체(1:600) 및 토끼 항-NF200 항체(1:2000), 신경섬유 마커인 0.4mL의 차단 용액에 넣습니다. 절편을 PBS로 헹구고 염소 항토끼 Alexa 594-접합 IgG(1:1,000) 및 염소 항-마우스 Alexa 488-접합 IgG(1:1,000) 2차 항체가 포함된 차단 용액 0.4mL를 실온에서 1시간 동안 추가합니다. 형광 현미경으로 각각 594nm 및 488nm 파장의 자동 파노라마 스캔을 통해 10x로 이미지를 촬영합니다(그림 6).형광 현미경을 켜고 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 형광 채널로 전환하고 위치 지정 키를 사용하여 조직에 3-4 개의 지점을 배치하고 초점을 맞추어 촬영을 완료합니다. 촬영이 끝나면 다른 채널의 이미지를 원하는 형식으로 저장 한 다음 병합 된 이미지를 저장하십시오.