基于微创技术的小鼠挫伤脊髓损伤模型的建立

注：所有实验均经山东大学奇鲁医学院实验动物伦理与福利委员会批准（批准号：21L60），并根据美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，1996年修订）进行。 1.脊髓损伤同轴平台的机理及力学试验 用外科手术台、椎体稳定器和冲击器尖端组装平台（图 1）。注意：保持砝码下降和排气槽清洁，以防止砝码遇到气流，因为砝码下降或套筒上的任何污垢都可能影响平台的精度。 将可以准确定位脊髓的尖端放入袖子中。 为实验选择适当的体重下降质量，轻度、中度和重度组分别为 1.3 g、2.0 g 和 2.7 g。 将拉销插入砝码下降的孔中。 将重压下降到套筒顶部，将拉销安装在 X-Y-Z 臂的凹槽中，以便一旦定位完成，重量就会释放以撞击撞击器尖端，从而震动脊髓，并在显微镜下观察脊髓的变化。 为方便操作员，调整可拆卸的 0.1 mm 精密 X-Y-Z 臂，以提供足够的工作空间（图 1D、E）。注意：为了确认研究结果的一致性，在实验开始之前，使用峰值压力检测装置测量将重量落入套筒内时产生的力。未来的研究不需要重复确认。 打开设备，将金属压力接收器放在尖端下方，将适配器归零，松开拉销，并记录实际冲击力。 2.第9胸椎定位和椎板切除术（T9） 注：9-10周龄的雌性C57BL / 6J小鼠购自济南鹏跃实验动物公司（中国济南）。 高压灭菌一套用于实验的手术器械，并在手术前用75%的酒精对手术台进行消毒。 麻醉前30分钟注射丁丙诺啡镇痛（0.05-2.0mg / kg，SQ），用于损伤手术。然后，用异氟醚麻醉小鼠（诱导：~3%-5%，维持：~1.5%-2%）。检查动物是否被尾巴或脚趾捏的反射完全麻醉。麻醉生效后，将鼠标置于手术台指定部位的俯卧位置，并在角膜上涂上眼药膏（在角膜上涂抹眼药膏以保护眼睛在手术过程中不干燥）。用胸腰椎上的电动剃须刀剃除从尾部到嘴部的头发。用碘伏对皮肤进行打圈消毒数次30秒，然后用75%的酒精消毒。应用无菌手术单，并用手术刀和刀片在大约T6至T13的皮肤上做一个约1.5厘米的纵向切口。注意：沿肋缘触诊至中线，T12-T13棘间隙位于中线。在嘴部切开1.5厘米的切口，切口与T6-T13椎骨大致齐平。 在手术显微镜下从骨部分探索一侧的第 13 根肋骨。通过轻轻触摸肋脊角区域，然后朝向喙部以定位 T12-T13 的棘间隙，探索中线的棘突。探索T9-T10从T12-T13的空间到耳廓侧的棘间空间。（图2A、3A） 用微型剪刀将椎旁肌肉沿着T9的棘突解剖到两侧的前小关节和后关节（图3B）。用微型牵开器收回椎旁肌肉，并用微型剪刀清洁叶片上的软组织以及T8-T9和T9-T10的棘突间隙。 进行T9椎板切除术，用显微手术钳夹住T9的棘突，将其稍微抬起，将微型剪刀沿椎板右侧背外侧平行插入，避免损伤脊髓，并用微型剪刀切断叶片。在左侧重复，脊髓可以暴露（图2B，3C）。 在固定椎骨之前，松开万向臂，并用椎体稳定器的微型蚊钳缓慢夹住椎骨两侧的第9至10小面关节。拧紧微型蚊钳上的螺钉，从而稳定椎骨。将脊髓调整到水平面，收紧万向臂，固定椎骨（图3D）。 3.T9挫伤 一旦T9水平脊髓暴露并且椎骨固定，通过操作显微镜下的袖子内的尖端瞄准脊髓（图3E）。 检查尖端的表面是否从脊髓的后侧和侧面平行于脊髓，因为在显微镜下很容易观察到脊髓和尖端之间的关系，并且手术台可以很容易地转动。 在椎板切除术后尖端与脊髓接触之前，检查尖端表面是否平行于备用薄片的双侧边界，因为它是平行于脊髓的自然参考平面。 定位T12-T13的棘间隙后，降低套筒，直到撞击器的末端与观察窗上的标记一致并达到22毫米的指定高度。拉出拉针以释放重量（根据组1.3g，2.0g或2.7g，每组包括3只小鼠，每组每个时间点有一只鼠标）。注意：脊髓应平行于地面并垂直于尖端;移动手术台以确保微观视野，因为手术台非常紧凑。 挫伤完成后取下撞击器，在手术显微镜下观察SCI的程度。在轻度组中，可以看到浅红色改变，而在中度组中，损伤部位在3-4秒内表现出深红色，并且可能观察到突出。在重度组中，暗红色表现可能立即出现，硬脑膜明显突出，但硬脑膜仍呈一致形状（图3F）。 用缝合线缝合浅筋膜和皮肤（聚丙烯不可吸收缝合线，尺寸：6-0）。 缝合完成后，对手术区域进行消毒，将鼠标放在温控垫上，直到完全恢复意识，然后将鼠标放入小鼠笼中。 4. 动物护理 将动物放在加热垫上进行恢复，并观察双后肢的运动。注意：接受手术的动物在完全康复之前不应返回其他动物的陪伴下。 在笼子地板上放高水饮食，以便动物可以轻松接触到食物。或者，使用带有较低喂食台的笼子。 手术后每天两次排空小鼠的膀胱，因为中度和重度损伤组难以恢复膀胱功能。注射丁丙诺啡镇痛（0.05-2.0mg / kg，SQ）8-12小时/天，持续3天。 5.经心灌注、染色和免疫染色 在损伤后第1天，第28天和第56天，通过灌注分别处死每组的一只小鼠。过度麻醉后，用60mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）和20mL4%多聚甲醛（4%-6%异氟醚）灌注小鼠。 用微型剪刀收集脊柱，分别从病变中心向嘴部和尾部延伸1厘米。 切除多余的肌肉，保留带有部分肋骨的完整脊柱节段，以便在步骤5.1.4中保持仪器，并将其浸泡在4%多聚甲醛中24小时。 用止血钳夹住肋骨进行固定，并根据切除的椎板和脊髓病变中心的颜色改变在显微镜下确定病变中心。 用尾部的微型剪刀切除所有椎板和关节突。 用微型剪刀切断神经根，取出脊髓。 用微型剪刀收集0.5厘米的脊髓，分别从病变中心向尾部和喙部延伸。 将脊髓置于4°C的30%蔗糖中48小时。 冷冻后根据组织学检查类型将组织切成6μm厚的切片。 进行苏木精和伊红（H&E）染色。将切片重新加热至室温，并将6μm厚的切片浸泡在4%甲醛中约15分钟，然后在1x PBS中浸泡1分钟四次以除去残留的OCT。 用苏木精染色切片90秒，然后用双蒸水冲洗。 然后，用流水清洗切片3分钟。 用伊红染色4分钟，并在95%酒精中浸泡30秒两次，以冲洗多余的曙红。 最后，用梯度酒精（95%酒精和50%酒精一次，依次）脱水30秒，并在二甲苯中浸泡2分钟。然后，用树脂凝胶密封试样（冠状面部分：图 4;矢状面部分： 图5）。 进行免疫荧光染色。将切片重新加热至室温，并将6μm厚的切片浸泡在4%甲醛中约2分钟。 在TBST中清洗切片5分钟，持续三次。 用封闭溶液（PBS中的10%山羊正常血清）孵育切片并封闭1小时以阻止免疫球蛋白的非特异性结合。 将脊髓切片在4°C下孵育过夜，同时用小鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP，反应性星形胶质细胞的标志物），多克隆抗体（1：600）和兔抗NF200抗体（1：2000），神经丝的标志物在0.4mL封闭溶液中。 用PBS冲洗切片，并在室温下加入0.4mL带有山羊抗兔Alexa 594偶联IgG（1：1，000）和山羊抗小鼠Alexa 488偶联IgG（1：1，000）二抗的封闭溶液1小时。 用荧光显微镜分别以594 nm和488 nm的波长进行自动全景扫描，以10倍拍摄图像（图6）。打开荧光显微镜，将载玻片放在显微镜载物台上，切换到荧光通道，使用定位键在组织上定位三到四个点，对焦完成拍摄。完成拍摄后，以所需格式保存不同通道的图像，然后保存合并的图像。