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Abstract
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免疫学と感染

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4病理学科,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

概要

이 프로토콜은 인간 호중구에서 β2 인테그린 활성화를 억제하는 저분자 약물을 식별하기 위한 유세포 분석 기반의 고처리량 스크리닝 방법을 설명합니다.

Abstract

이 프로토콜은 구조적 변화 보고 항체 및 고처리량 유세포 분석을 활용하여 β2 인테그린 활성화의 소분자 길항제를 식별하는 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 또한 다른 항체 기반 고처리량 스크리닝 방법에 대한 가이드 역할을 할 수 있습니다. β2 인테그린은 면역 반응에 중요한 백혈구 특이적 접착 분자입니다. 호중구는 혈류를 빠져나가기 위해 인테그린 활성화에 의존하며, 감염과 싸울 뿐만 아니라 여러 염증성 질환에도 관여합니다. β2 인테그린 활성화를 조절하는 것은 호중구 관련 염증성 질환을 치료하기 위한 실행 가능한 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 β2 인테그린의 고친화성 헤드피스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체인 mAb24를 사용하여 분리된 1차 인간 호중구에서 β2 인테그린 활성화를 정량화합니다. N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌(fMLP)은 호중구 β2 인테그린을 활성화하기 위한 자극제로 사용됩니다. 이 연구에서는 384웰 플레이트 샘플을 자동으로 실행할 수 있는 고처리량 유세포 분석기를 사용했습니다. β2 인테그린 억제에 대한 320가지 화학 물질의 효과는 3시간 이내에 평가됩니다. β2 인테그린을 직접 표적으로 하는 분자 또는 G 단백질 결합 수용체 개시 인테그린 인사이드-아웃 활성화 신호 경로에서 분자를 표적으로 하는 분자는 이 접근법을 통해 식별할 수 있습니다.

Introduction

많은 염증성 질환은 부종이나 부상 부위에 호중구가 침윤하는 것이 특징이다1. 이러한 조직에 침투하기 위해 호중구는 내피에 대한 체포, 혈관 벽을 통한 유출 및 조직 내로의 모집을 포함하는 호중구 모집 캐스케이드를 완료해야 합니다2. 순환 호중구는 특히 정지 단계에서 이 캐스케이드를 완료하기 위해 β2 인테그린 활성화가 필요합니다. 따라서 호중구 부착, 외래 및 모집을 감소시키는 인테그린 억제 약물은 염증성 질환을 효과적으로 치료할 수 있습니다 3,4.

β2 인테그린은 이전에도 염증성 질환의 표적이 된 적이 있습니다. 인테그린 αLβ2를 직접 표적으로 하는 단클론 항체인 에팔리주맙(Efalizumab)은 건선5를 치료하기 위해 개발되었습니다. 그러나 에팔리주맙은 JC 바이러스 재활성화로 인한 진행성 다발성 백질뇌병증이라는 치명적인 부작용으로 인해 철회되었다 6,7. 새로운 항염증 인테그린 기반 요법은 부작용을 최소화하기 위해 백혈구의 항감염 기능을 유지하는 것을 고려해야 합니다. 에팔리주맙의 부작용은 혈류 내 단일클론항체의 장기적 순환으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 장기적으로 면역 기능을 저해할 수 있다8. 최근 연구에 따르면 에팔리주맙은 αLβ2 교차결합과 α4 인테그린의 원치 않는 내재화를 매개하여 부작용에 대한 대안적 설명을 제공한다9. 따라서 수명이 짧은 저분자 길항제는 이 문제를 피할 수 있습니다.

인간 호중구를 사용하여 저분자 β2 인테그린 길항제를 스크리닝하는 고처리량 분석법이 여기에 제시되어 있습니다. β2 인테그린 활성화는 리간드에 접근하고 결합 친화도를 높이기 위해 인테그린 엑토도메인의 구조적 변화를 필요로 합니다. 표준 스위치블레이드 모델에서, 벤트-클로즈드 인테그린 엑토도메인(benent-closed integrin ectodomain)은 먼저 확장-폐쇄 형태(extended-closed conformation)로 연장된 다음, 완전히 활성화된 확장-개방 형태(10,11,12,13)로 그 헤드피스를 개방한다. 구부러진 닫힘에서 구부러진 열림 및 확장 열림으로 시작하여 결국 14,15,16,17,18,19로 시작하는 대체 경로도 있습니다. 형태 특이적 항체 mAb24는 엑토도메인의 헤드피스가 열려 있을 때 인간 β2-I 유사 도메인의 에피토프에 결합합니다(20,21,22,23).

여기서, mAb24-APC는 β2 인테그린의 활성화 여부를 결정하기 위해 사용된다. 호중구와 인테그린을 활성화하기 위해, 호중구 β2 인테그린을 활성화할 수 있는 박테리아 유래 짧은 화학주성 펩타이드인 N-포르밀메티오닐-류실-페닐알라닌(fMLP)이 이 프로토콜에서 자극제로 사용됩니다. fMLP가 호중구의 Fpr1에 결합하면 G-단백질, 포스포리파제 Cβ 및 포스포이노시티드 3-키나아제 γ와 관련된 다운스트림 신호 캐스케이드가 활성화됩니다. 이러한 신호전달 사건은 궁극적으로 인사이드-아웃(inside-out) 신호전달 경로(18,25)를 통해 인테그린 활성화를 초래한다. β2 인테그린에 직접 결합하고 인테그린 활성화26의 구조적 변화를 방지하는 저분자 길항제 외에도, β2 인테그린 인사이드-아웃 활성화 신호 경로의 성분을 억제할 수 있는 화합물도 이 방법으로 검출할 수 있습니다. 자동 유세포 분석기는 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다. 새로운 길항제를 식별하면 인테그린 생리학에 대한 이해를 심화할 수 있을 뿐만 아니라 인테그린 기반 항염증 요법에 대한 중개적 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Protocol

헤파린화된 전혈 샘플은 헬싱키 선언의 원칙에 따라 UConn Health의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board of UConn Health)에서 승인한 정보에 입각한 동의를 얻은 후 식별되지 않은 건강한 인간 기증자로부터 획득되었습니다. 모든 기증자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 이 연구의 포함/제외 기준은 참가자의 적합성을 보장하고 잠재적 위험을 최소화하기 위해 신중하게 개발되었습니다. 적격 …

Representative Results

대표적인 384웰 플레이트 스크리닝 데이터(그림 4)에 따르면 음성 대조군은 mAb24-APC의 MFI가 3236 ± 110인 반면, 양성 대조군은 mAb24-APC의 MFI가 7588 ± 858이었습니다. 이 플레이트의 Z’ 계수는 약 0.33으로, 허용 범위31 내에 있습니다. 그러나 Z’는 2차 분석에서 추가 검증이 필요합니다. 데이터를 정규화하기 위해 양수 평균에 최대값 1을 할당하고…

Discussion

호중구 자극 및 염색의 시작과 종료는 호중구와 고정제 PFA의 첨가에 의해 결정됩니다. 따라서 호중구 또는 PFA를 각 컬럼에 피펫팅하는 사이에 동일한 시간 간격을 유지하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 각 웰에서 호중구의 자극 및 염색 시간이 일정하게 유지됩니다. 호중구의 수명이 짧기 때문에 기증자로부터 혈액을 채취하는 것부터 유세포 분석 완료에 이르기까지 전체 실험을 같은 날에 수?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

유세포 분석에 도움을 주신 UConn Health의 유세포 분석 코어의 Evan Jellison 박사와 Li Zhu 박사, 기기를 지원해 주신 UConn Health 면역학과의 Lynn Puddington 박사, 혈액 샘플 채취에 도움을 주신 UConn Health의 임상 연구 핵심 부서의 Slawa Gajewska 박사와 Paul Appleton 박사에게 감사드립니다. 이 원고의 과학적 집필 및 편집에 도움을 주신 UConn School of Medicine의 Christopher “Kit” Bonin 박사와 Geneva Hargis 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 미국 국립심장폐혈액연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute, R01HL145454), 미국 국립종합의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, P20GM121176), 미국심장협회(American Heart Association)의 경력개발상(Career Development Award, 18CDA34110426), UConn Health의 스타트업 펀드의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
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参考文献

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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
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