スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

1. 細胞培養プロトコル 初代ヒト筋芽細胞培養細胞外マトリックス(ECM)を氷上で8 mLのDMEM/F12培地で1:100の比率で希釈します。 8 mLのECM溶液を1つのT175フラスコに塗布し、細胞播種の前に少なくとも1時間、ただし24時間以内に37°Cでインキュベートします。ECMソリューションがフラスコの底部全体を覆っていることを確認します。 5 mLの骨格筋成長培地を15 mLのコニカルチューブに分注します。 凍結した細胞バイアル(5.0 x 105 筋芽細胞)を37°Cの水浴中で2分間、または氷が溶けるまで解凍します。バイアルに70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネット(BSC)に移します。 P1000を使用して細胞を分注培地に移します。粉砕しないでください。細胞を300 x g で3分間遠心分離します。 上清を吸引し、P1000ピペットを使用して1 mLの増殖培地に細胞を再懸濁して、単一の細胞懸濁液を達成します。 ECMコーティングされたフラスコを15 mLのDPBSで洗浄します。DPBSを吸引し、30mLの成長培地をフラスコに加えます。 4 mLの増殖培地を細胞に加え、混合して、細胞懸濁液をT-175フラスコに分配します。総容量が35mLであることを確認してください。フラスコの表面に沿ってフラスコを左右に5〜6回静かにスライドさせ、続いて前後に5〜6回スライドさせて、フラスコ表面上の細胞が均一に分布するようにします。 T-175フラスコを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターに入れます。細胞を3日間、またはコンフルエント度が70%以下になるまで培養し、次いで細胞を継代する。 初代ヒト筋芽細胞の継代氷上で30 mLのDMEM/F12培地でECMを1:100の比率で希釈します。 10 mLのECM溶液を3つのT225フラスコに塗布し、細胞播種の前に少なくとも1時間、ただし24時間以内に37°Cでインキュベートします。ECMソリューションがフラスコの底部全体を覆っていることを確認します。 細胞を15 mLのDPBSで洗浄します。解離試薬を吸引し、ベンダーのプロトコルに従って追加します。 細胞が持ち上げられたら、ベンダーのプロトコルに従って反応を停止し、細胞を円錐形のチューブに集めます。細胞を300 x g で3分間遠心分離します。 上清を吸引し、P1000ピペットを使用して1 mLの増殖培地に細胞を再懸濁して、単一の細胞懸濁液を達成します。 ECMコーティングされたフラスコを15 mLのDPBSで洗浄します。DPBSを吸引し、次いで40mLの増殖培地を各T225フラスコに加える。 14 mLの増殖培地を細胞懸濁液に加え、混合し、5 mLの細胞懸濁液を各T225フラスコに分配します。各フラスコの総容量が45mLであることを確認してください。フラスコを作業面に沿って左右に5〜6回静かにスライドさせ、続いて前後に5〜6回スライドさせて、均等に分散させます。 フラスコを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターに入れる。 細胞を2〜3日間、またはコンフルエントが70%以下になるまで培養し、その後継代します。各継代でセルを1:3または1:4で分割し、3 x 103 と1 x 104 セル/ cm2の間にシードします。 ヒプロップス由来心筋細胞培養氷上で12 mLのDMEM/F12培地でECMを1:60の比率で希釈します。 1 mLのECM溶液を2つの6ウェルプレートの各ウェルに適用し、細胞播種の前に少なくとも1時間、ただし24時間以内に37°Cでインキュベートします。 心筋細胞の凍結バイアルを37°Cの水浴中で2分間、または氷が溶けるまで解凍します。 バイアルに70%エタノールをスプレーし、BSCに移します。 p1000ピペットを使用して、解凍した細胞を50 mLコニカルチューブに移します。 空のクライオバイアルを1 mLの室温(RT)メッキ培地ですすぎ、残りの細胞を回収します。 1 mLのリンス培地を90秒かけて細胞の円錐形のチューブに滴下(5秒ごとに1滴)ゆっくりと分注します。チューブを連続的に旋回させて、遅い培地添加中に細胞を混合します。 10 mLの血清学的ピペットを使用して、8 mLのプレーティング培地を50 mLのコニカルチューブにゆっくりと加えます。 すべての培地を分注した後、細胞を完全に混合するために3回ゆっくりと上下にピペットします。血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞をカウントします。 50 mLコニカルチューブ内の細胞を300 x g で3分間遠心分離します。 細胞がペレット化された後、上清を吸引する。 p1000ピペットを使用して1 mLのメッキ媒体をチューブに移し、ゆっくりと上下に3〜5回ピペッティングしてペレットを静かに分解します。追加のメッキ培地で細胞を再懸濁します。 2mLのプレーティング培地中の6ウェルプレートの1ウェルあたり2〜4 x 106 セルの間に播種する。 ECMコーティングされた6ウェルプレートをDPBS(2 mL/ウェル)で洗浄します。 6ウェルプレートの1ウェルあたり2mLの細胞懸濁液をピペットで入れる。プレートを作業面に沿って左右に5〜6回ゆっくりと動かし、続いて前後に5〜6回動かして、プレート表面に細胞が均一に分布するようにします。 プレートを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターに入れる。 解凍する細胞のすべてのバイアルに対して手順1.3.3〜1.3.16を繰り返します。 プレーティングの翌日に3〜5 mLの維持培地(細胞株と密度に応じて)に変更し、その後1日おきに培地を交換します。細胞を3〜4日間培養してから、3D組織にキャストします。 間質細胞培養30 mLのECM溶液をT175フラスコに塗布し、細胞播種前に37°Cで少なくとも1時間、ただし24時間以内にインキュベートします。 5 mLのストローマ細胞培地を15 mLのコニカルチューブに分注します。 間質細胞の凍結バイアルを37°Cの水浴中で2分間、または氷が溶けるまで解凍します。 バイアルに70%エタノールをスプレーし、BSCに移します。 p1000ピペットを使用して、1 mLのストローマ細胞培地をバイアル内の解凍した細胞にゆっくりと加えます。 細胞懸濁液をバイアルから円錐管内の残りの融解培地に移す。5 mLの血清学的ピペットを使用して細胞を混合します。ピペットを上下に3回行います。 血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞をカウントします。セルをスピンダウンしないでください。 ECMコーティングされたT175フラスコを15mLのDPBSで洗浄します。 間質細胞を3-4 x 103 細胞/cm2の密度でフラスコに移します。フラスコの表面に沿ってフラスコを左右に5〜6回静かにスライドさせ、続いて前後に5〜6回スライドさせて、フラスコ表面上の細胞が均一に分布するようにします。 翌日、加温した間質細胞培地45 mLで培地を交換します。細胞を3〜4日間培養してから、3D組織にキャストします。 2.材料の準備 フィブリノーゲン注意: フィブリノーゲンを再構成するときは、フィブリノーゲン粉末が層状になっている表面積の量を最大化するように注意してください。このプロトコルでは、使用される希釈剤の量は、使用される容器のサイズに最適化されました、すなわち、皿の底を覆うのにちょうど十分な希釈剤が使用されました。例えば、50 mLの遠沈管ではなく、100 mmのディッシュに10 mLのPBSの上に0.5 gのフィブリノーゲンを層状にします。希釈液の表面積量を最大化すると、フィブリノーゲンの再構成に必要な時間が短縮され、タンパク質の潜在的な凝集が減少します。再構成10 mLのPBSを100 mm細胞培養皿に移し、細胞培養インキュベーター内で37°Cに温めます。 温かいPBSの表面全体にフィブリノーゲン粉末0.5 gを重ね、フィブリノーゲンが完全に溶解するまで37°Cに保ちます。これには2時間以内で完了します。溶解粉末は穏やかに渦巻くことができますが、皿を激しく振らないでください。 滅菌ろ過粉末が完全に溶解したら、溶液を100 μmのフィルターに通し、50 mLのコニカルチューブに集めて、ゲル化したフィブリノーゲンの塊を取り除きます。 ろ過した溶液を、0.2 μmフィルターでキャップした10 mLシリンジに注ぎます。溶液をフィルターに通し、新しい50 mLコニカルチューブに集めます。10 mLの溶液すべてを滅菌するには、フィルターを複数回交換する必要がある場合があります。 300 mLの滅菌フィブリノーゲンを1.5 mLの微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。 必要に応じて、氷上または4°Cでアリコートを解凍します。凍結/解凍の繰り返しは避けてください。 トロンビン6 mLのPBSと4 mLのdiH2Oを1つのバイアルのトロンビン(1 KU)に直接加え、100 U / mLのトロンビンストック溶液を作ります。 フィルターは0.2 μmのフィルターで滅菌し、アリコートし、トロンビンがガラスに吸着するため、1.5 mLのプラスチックマイクロ遠心チューブに-20°Cで保存します。凍結/解凍の繰り返しは避けてください。 ポリ(エチレンイミン)溶液(PEI)注意:PEIは有毒です。製造元が指定した適切なPPEを使用してください。注:PEIは50%W / Vソリューションとして提供されます。粘度が高く、ピペットが難しいです。50%w/v溶液から直接ではなく、10%ストック溶液から0.1%溶液を作ります。50 mLのコニカルチューブで5 mLの50%w / v PEI溶液を測定します。 20 mLのdiH2Oを加えて混合し、10%ストック溶液を生成します。この高濃度のストック溶液は、滅菌ろ過できません。 細胞培養用の0.1%溶液を作るには、5 mLの10%ストックを495 mLのdiH2Oに加えます。 500 mLのフィルターフラスコを使用して滅菌フィルターを使用し、RTで1週間以内保管します。 グルタルアルデヒド注意: グルタルアルデヒドは有毒です。製造元が指定した適切なPPEを使用してください。グルタルアルデヒドは25%溶液として供給されます。0.01%溶液を作るには、99.6 mLのdiH2Oに40 μLを加え、滅菌フィルターで4°Cで1週間以内保存します。 事後準備消耗組織鋳造キットを滅菌培養フード内に置きます。キャスティングキットには、蓋、24対の支柱を保持する支柱格子(24ウェルプレートのウェルごとに1対の支柱)、および24個の鋳造ウェルを含む特殊な24ウェルプレート底部が含まれています。各キャスティングウェルの底部には、セル/ヒドロゲル成分を保持し、ヒドロゲルが重合するときにチューブ状の組織に成形するためのトレンチが含まれています(図1B)。 24ウェルプレートのウェルに1.5 mL/ウェルの0.1%PEI溶液を満たし、ポストの各ペアの先端が水没するようにポストをプレートに配置します。10分間放置します。 PEIはポストに正電荷を沈着させ、組織キャスティング中にヒドロゲル中のタンパク質がポストにしっかりと付着するようにします。 2番目の24ウェルプレートのウェルに2 mL/ウェルの滅菌diH2Oを満たし、ポストを移します。1分間放置します。 3番目の24ウェルプレートで、ウェルに0.01%グルタルアルデヒド(GA)の1.5 mL/ウェルを満たし、ポストを移します。30分間放置します。 GAはPEIからポストへの正電荷を修正します。 ポストをグルタルアルデヒドに入れたまま、diH 2 Oウェルを吸引し、2 mL /ウェルの滅菌diH 2 Oで洗浄し、吸引し、2 mL /ウェルの滅菌diH2Oを補充します。すすぎの代わりに、新鮮な24ウェルプレートを使用できます。 30分が経過したら、ポストを滅菌diH 2 Oの2mL /ウェルに移します。1分間放置します。 diH 2 Oを吸引し、滅菌diH 2 Oをさらに2mL /ウェル加えます。5分間放置します。 ポストを24ウェルプレートに移して乾燥させます(約15分)。 乾いたら、キャスティングキットを組み立て直します。蓋とプレートを一緒に密封するために端をパラフィルム化し、細胞播種の前に4°Cで最大72時間保存します。より長い保管時間は可能かもしれませんが、テストされていません。 3.ティッシュキャスティングプロトコル 鋳造プレートの準備ティッシュキャスティングキットを4°Cでプレチルします。 氷の入ったバケツをBSCに移します。氷上で、キャストするウェルあたり50 μLのトロンビン溶液(3 μLのトロンビンストック+ 47 μLのEMT培地)を準備します。注意: EMTメディアの詳細については、手順3.2.1を参照してください。 冷やしたキャスティングキットを冷蔵庫から取り出し、細胞培養フード内のコールドブロックまたは氷の上に置きます。キャスティングプレートを氷の上に平らに置き、ポスト格子をキャスティングプレートから新しい滅菌24ウェルプレートに移動します。 50μLのトロンビン溶液をキャスティングプレートの各予備冷却ウェルにピペットで入れる。 キットを組み立て直し、ティッシュキャスティングに必要になるまで冷蔵庫に戻します。ウェルに加えてトロンビンから3時間以内に組織をキャストします。 細胞調製EMTベース培地、滅菌フィルターを準備し、氷上に置いておきます。注:細胞特異的キャスト培地にFBSが含まれている場合は、フィブリノーゲンと相互作用して早期重合を引き起こす可能性があるため、熱不活性化FBSを使用してください。心臓EMT培地の準備:500 mLのRPMI培地、10 mLのB27、および2.5 gのアミノカプロン酸を追加します。(オプション)10 mM ROCK阻害剤を追加します(500 mL容量全体ではなく、組織の鋳造に使用されるEMT培地にのみ追加します)。 骨格EMT培地の調製:一次EMTにはF10培地50 mL、アミノカプロン酸(ACA)0.25 g、iPS細胞由来EMTにはACA0.1 gを加えます。 細胞培養グレードの解離試薬を37°Cに温めます。 等量のEMT培地を温めて解離試薬を希釈します。注:使用するプロテアーゼが完全に不活性化されていることが重要です。活性プロテアーゼは、3D組織形成および接着後を妨害します。 細胞(図1A)をPBSで洗浄します。6ウェルプレートには2 mL/ウェルを使用してください。100 mmディッシュ、T175フラスコ、T225フラスコには、それぞれ6 mL、15 mL、15 mLを使用します。 加温した細胞培養グレードの解離試薬を加えて細胞を持ち上げ、37°Cで5分間、または細胞が持ち上がるまでインキュベートします。心臓培養には、10倍解離試薬を使用してください。間質細胞および骨格筋芽細胞には、1倍の解離試薬を使用してください。6ウェルプレートには1 mL/ウェル、100 mmディッシュには3 mL、T175フラスコには8 mL、T225フラスコには10 mLを使用します。 プレートの側面をタップして、2〜3分ごとに培養を確認します。 細胞が持ち上げられたら、50 mLのコニカルチューブに移し、P1000ピペットで粉砕して単一細胞懸濁液を確保します。 プレートまたはフラスコを追加のEMT培地で洗浄して残りの細胞を収集し、それらを円錐管に加える。6ウェルプレートには1 mL/ウェルのEMT培地、100 mmディッシュには2 mL、T175フラスコには5 mL、T225フラスコには5 mLを使用します。 細胞を粉砕して、単一の細胞懸濁液を確実にする。 EMT培地を加えて解離プロセスを終了し、細胞数のために細胞懸濁液のサンプルを採取します。6ウェルプレートには1 mL/ウェル、100 mmディッシュには3 mL、T175フラスコには8 mL、T225フラスコには10 mLを使用します。 細胞を200 x g で4分間回転させます。懸濁液を遠心分離しながら、血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞カウントを実行します。 上清を吸引し、細胞を5 mLのEMTベース培地に再懸濁して、残留解離試薬を除去します。 細胞を200 x g で4分間遠心分離します。上清を吸引し、適切な密度で細胞懸濁液を調製します。 EMT培地に10%〜20%のECMタンパク質を添加することにより、3D骨格筋EMTの寿命と機能を高めます14,16。 種子幹細胞由来心筋細胞およびそれらの間質細胞は、組織構築物あたりそれぞれ5 x 10 5細胞および7.5 x 104 細胞である。骨格筋筋芽細胞を組織構築物あたり7.5 x 105 細胞で播種します。 心臓組織上清を吸引し、間質細胞をEMT培地に1mLあたり2.5 x 106 細胞の密度で再懸濁し、氷上に置きます。EMTあたり30μLのこの懸濁液を使用してください。 上清を吸引し、CMSをEMT培地に1mLあたり8.3 x 106 細胞の密度で再懸濁し、氷上に置きます。EMTあたり60μLのこの懸濁液を使用してください。 骨格筋組織上清を吸引し、骨格筋細胞をEMT培地に1mLあたり8.3 x 106 細胞の密度で再懸濁し、氷上に置きます。EMTあたり90μLのこの懸濁液を使用してください。 必要な組織数を構成するために必要な各細胞溶液の量を計算します(たとえば、EMTあたり60 μLの調製されたCMと30 μLの準備された間質細胞または90 μLの骨格筋細胞)。 計算された細胞量を15 mLのコニカルチューブにピペットで入れます。 EMTあたり10 μLのフィブリノーゲンを細胞懸濁液に加え、氷上に保ちます。 EMTあたりの総試薬と細胞量:各EMTに90μLの細胞、10μLのフィブリノーゲン、および50μLのトロンビン溶液があることを確認してください。 ティッシュキャスティング組織キャスティングキットを細胞培養フードに移し、蓋を取り外します(柔軟で剛性のあるポストを含むポスト格子はキャスティングプレートに残しておく必要があります。 図1B)。ポスト格子でキャスティングプレートを氷の上に平らに置きます。 細胞/フィブリノーゲン混合物を混合し、P200ピペットで100 μLを吸引します。 50 μLのトロンビン溶液で調製したウェルに100 μLの混合物を添加し、5回粉砕してよく混合します。ピペットを最初のストップを超えて押したり、気泡が発生しないように粉砕後にチップを取り外したりしないでください。 この段階で、ポスト格子をキャスティングプレートから持ち上げる準備ができるまで(ステップ3.3.10)、格子の動きは、ポストへの組織の長期的な付着を損なう可能性があります。格子の動きを避けるために、片方の手の人差し指と親指を使用して、格子と鋳造ウェルプレートの両方を同時に持ちます。 すべての組織がキャストされるまで、各組織に新しいP200チップで繰り返します。細胞が迅速に沈降するので、各組織をキャストする前に、15 mLのコニカルチューブで細胞懸濁液を混合します。 播種したキットをインキュベーターに慎重に移し、格子を動かさないようにします。播種後の格子の移動は、キャスティングウェルからの組織移送の成功率を低下させる可能性がある。細胞の種類に関係なく、37°Cで80分間インキュベートします。これによりヒドロゲルの重合が開始され、タンパク質がポストに付着するようになります。 その間、心臓組織用のEMT培地2 mL/ウェルを含む新しい24ウェルプレートを準備します。所望により、10mM ROCK阻害剤をEMT培地に添加してもよい。プレートを37°Cでインキュベートし、培地を温めます。 一次骨格筋組織には5 g/Lアミノカプロン酸(0.2 mm滅菌ろ過)を含む2 mL/ウェルの増殖培地を、iPS細胞由来のEMTには2 g/L ACAを調製します。プレートを37°Cでインキュベートし、培地を温めます。 インキュベート後、1 mLのEMT培地をキャスティングウェルの端に穏やかに加え、細胞の種類に関係なく、37°Cでさらに10分間インキュベートします。これにより、ヒドロゲルがキャスティングウェルの端から外れ、組織を簡単に移動できるようになります。 10分後、ポスト格子を注意深く持ち上げ、組織をキャスティングプレートから培地で準備した24ウェルプレートに移します(図1C)。組織を入れたプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに戻します。 メンテナンス24時間後、キャスト組織を2 mL/ウェルのEMT培地(ROCK阻害剤が含まれている場合は含まず)を入れた新しい24ウェルプレートに移し、37°Cでインキュベートします。 骨格筋細胞の場合、増殖培地を分化培地に切り替えて筋芽細胞の融合を促進します。 心臓組織を2〜3日ごとに2 mL /ウェルのEMT培地を含む新しいウェルに移します。 骨格筋組織を、5 g / Lアミノカプロン酸(0.2 mm滅菌ろ過)を含む2 mL /ウェル分化培地を使用して、2〜3日ごとに新しいウェルに移します。iPS細胞由来の組織には2 g/L ACAを使用してください。 培地の交換を支援するには、3D組織の損傷を避けるために、同じプレート内の培地を交換するのではなく、ポスト格子を新しい24ウェルプレートに移します。EMT培地を含む2枚目の24ウェルプレートを準備し、組織を新鮮な培地に移します。プレートを古い培地と一緒に活性培養物と一緒に保管し、次の培地交換に使用します。培養期間を通して、ポスト格子を2つのプレート間で前後に移します。または、培地交換ごとに新しいプレートを使用します。 EMTの収縮は、ポストたわみの光学的追跡(図1D)または磁気センシングハードウェア13,14のいずれかを介して測定します。心臓組織は、培養3〜4日後に自発的に拍動し始めます。骨格筋組織は通常、培養7日後に電界刺激で収縮します。