Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.
Les premiers progéniteurs érythroïdes ont été définis à l’origine par leur potentiel de formation de colonies in vitro et classés en « unités » formant des éclatements et des colonies connues sous le nom de BFU-e et CFU-e. Jusqu’à récemment, il n’existait pas de méthodes pour l’isolement prospectif direct et complet des progéniteurs BFU-e et CFU-e purs de la moelle osseuse de souris adulte fraîchement isolée. Pour combler cette lacune, un ensemble de données monocellulaire RNA-seq (scRNAseq) de moelle osseuse de souris a été analysé pour l’expression de gènes codant pour des marqueurs de surface cellulaire. Cette analyse a été combinée à des essais de devenir cellulaire, ce qui a permis le développement d’une nouvelle approche cytométrique en flux qui identifie et permet l’isolement de sous-ensembles complets et purs de progéniteurs BFU-e et CFU-e dans la moelle osseuse ou la rate de souris. Cette approche identifie également d’autres sous-ensembles de progéniteurs, y compris des sous-ensembles enrichis en potentiels basophiles/mastocytes et mégacaryocytaires. La méthode consiste à marquer des cellules fraîches de la moelle osseuse ou de la rate avec des anticorps dirigés contre Kit et CD55. Les progéniteurs qui expriment ces deux marqueurs sont ensuite subdivisés en cinq populations principales. La population 1 (P1 ou UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/CD105 faible/CD71 élevé/élevé) contient tous les progéniteurs de l’UFC-e et peut être subdivisée en P1-faible (CD71med CD150 élevé) et P1-hi (CD71 élevé CD150faible), correspondant respectivement au début et à la fin de l’UFC-e; La population 2 (P2 ou BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 faible/CD71élevé faible CD150) contient tous les progéniteurs BFU-e; La population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/CD105élevé/CD150 faibleCD41 faible) est enrichie pour les progéniteurs basophiles/mastocytes; La population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 élevé/CD150faible à CD41+) est enrichie en progéniteurs mégacaryocytaires; et la population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 élevé/CD150faible CD41–) contient des progéniteurs à potentiel érythroïde, basophile/mastocytes et mégacaryocytaire (EBMP) et érythroïdes/mégacaryocytaires/basophiles. Cette nouvelle approche permet une plus grande précision lors de l’analyse des progéniteurs érythroïdes et autres progéniteurs hématopoïétiques et permet également de faire référence à des informations de transcriptome pour chaque population définie cytométriquement en flux.
L’érythropoïèse peut être divisée en deux phases principales : l’érythropoïèse précoce et la différenciation érythroïde terminale (Figure 1)1,2,3. Dans l’érythropoïèse précoce, les cellules souches hématopoïétiques s’engagent dans la lignée érythroïde et donnent naissance à des progéniteurs érythroïdes précoces, qui ont été identifiés pour la première fois dans les années 1970 en fonction de leur potentiel de formation de colonies en milieu semi-solide 4,5,6,7,8,9 . En gros, les progéniteurs érythroïdes sont divisés en deux catégories: les progéniteurs antérieurs qui donnent chacun lieu à un « éclatement » (un grand agrégat de petits amas de cellules érythroïdes), appelé « unité érythroïde formant un éclatement » ou BFU-e 4,5,6; et leur descendance, qui forment chacune un seul petit amas de cellules érythroïdes ou une seule colonie, appelée « unité érythroïde formant colonie » ou UFC-e 7,8,9. BFU-e et CFU-e n’expriment pas encore de gènes érythroïdes terminaux et ne sont pas morphologiquement reconnaissables. Après un certain nombre de divisions cellulaires d’auto-renouvellement ou d’expansion, l’UFC-e subit un commutateur transcriptionnel dans lequel des gènes érythroïdes tels que les globines sont induits, passant ainsi à la différenciation terminale érythroïde (ETD)1,10. Au cours de l’ETD, les érythroblastes subissent trois à cinq divisions cellulaires de maturation avant d’énucléer pour former des réticulocytes qui mûrissent en globules rouges.
Les érythroblastes au cours de la différenciation terminale ont été classés à l’origine en fonction de leur morphologie en proérythroblastes, basophiles, polychromatiques et orthochromatiques. L’avènement de la cytométrie en flux a permis leur tri prospectif et leur isolement en fonction de la taille des cellules (mesurée par diffusion directe, FSC) et de deux marqueurs de surface cellulaire, CD71 et Ter11911,12,13 (Figure 1). Cette approche et des approches similaires de cytométrie en flux 14 ont révolutionné l’étude des aspects moléculaires et cellulaires de l’ETD, permettant une analyse spécifique au stade de développement des érythroblastes in vivo et in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L’approche CD71/Ter119 est maintenant couramment utilisée dans l’analyse des précurseurs érythroïdes.
Jusqu’à récemment, une approche cytométrique en flux similaire et accessible pour l’isolement prospectif direct et de haute pureté de CFU-e et BFU-e à partir de tissus de souris a échappé aux chercheurs. Au lieu de cela, les chercheurs ont utilisé des stratégies de cytométrie en flux qui n’isolent qu’une fraction de ces progéniteurs, souvent en présence de cellules non érythroïdes qui co-purifient dans les mêmes sous-ensembles cytométriquesen flux 21. Par conséquent, l’étude de BFU-e et CFU-e s’est limitée aux systèmes de différenciation in vitro qui dérivent et amplifient BFU-e et CFU-e à partir de progéniteurs antérieurs de la moelle osseuse. Il est alors possible d’appliquer des stratégies de cytométrie en flux qui distinguent CFU-e de BFU-e dans ces cultures enrichies en progéniteurs érythroïdes22,23. Une autre approche utilise l’UFC-e et l’UFB-e fœtales, qui sont hautement enrichies en la fraction Ter119-négative du foie fœtal de souris au milieu de la gestation 10,24,25. Cependant, aucune de ces approches ne permet d’étudier l’état physiologique in vivo de l’UFC-e et de l’UFC-e chez l’adulte. L’ampleur du défi peut être appréciée si l’on se souvient que, sur la base des essais de formation de colonies, ces cellules sont présentes dans la moelle osseuse adulte à une fréquence de seulement 0,025% et 0,3%, respectivement6.
Le protocole décrit ici est une nouvelle approche de cytométrie en flux basée sur l’analyse transcriptomique unicellulaire de cellules de moelle osseuse de souris Kit+ fraîchement récoltées (Kit est exprimé par toutes les premières populations progénitrices de la moelle osseuse)1. Notre approche contient certains marqueurs de surface cellulaire qui étaient déjà utilisés par Pronk et al.21,26. Des transcriptomes unicellulaires ont été utilisés pour déterminer des combinaisons de marqueurs de surface cellulaire qui identifient les progéniteurs érythroïdes et autres progéniteurs hématopoïétiques précoces (Figure 2). Plus précisément, la fraction CD55+ des cellules Kit+ de lignée négative peut être subdivisée en cinq populations, dont trois produisent des segments contigus de la trajectoire érythroïde (figure 2). Les identités transcriptomiques de chacune de ces populations ont été confirmées par tri, suivi d’un scRNAseq et d’une projection des transcriptomes unicellulaires triés sur la carte transcriptomique originale (l’expression génique dans chacune des cinq populations et l’ensemble des données sur la moelle osseuse peuvent être explorés dans https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Le potentiel de devenir cellulaire de chacune des populations a été confirmé à l’aide d’essais traditionnels de formation de colonies (figure 2), ainsi que d’un nouveau test de devenir unicellulaire à haut débit 1,27. Ces analyses montrent que la nouvelle approche de cytométrie en flux permet d’isoler de haute pureté tous les progéniteurs BFU-e et CFU-e de la moelle osseuse et de la rate adultes fraîches. Plus précisément, la population 1 (P1) ne contient que l’UFC-e et aucun autre progéniteur hématopoïétique, et la population 2 (P2) contient tous les progéniteurs BFU-e de la moelle osseuse et un petit nombre d’UFC-e mais aucun autre progéniteur1. Le protocole détaillé ci-dessous est illustré par un exemple d’expérience chez des souris qui ont reçu une injection de solution saline ou de l’hormone stimulant l’érythropoïèse érythropoïétine (Epo).
La capacité d’isoler prospectivement les progéniteurs BFU-e et CFU-e directement à partir de tissus frais de haute pureté avait auparavant échappé aux chercheurs. Notre nouvelle approche, validée à l’aide de scRNAseq et des essais de destin cellulaire 1,27, offre maintenant les outils pour y parvenir.
Il existe un certain nombre de points clés pour exécuter avec succès les protocoles de tri et d’analyse. Tout d’abord…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par les subventions NIH R01DK130498, R01DK120639 et R01HL141402
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |