JoVE Journal > Neuroscience
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神経科学

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

概要

Bu protokol, ortaya çıkan nöroinflamatuar yanıtı ve nörotoksisiteyi incelemek için bir zebra balığı larva modelinde beyin ventriküler bölgesine lipopolisakkaritin mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Abstract

Nöroinflamasyon, nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli nörolojik bozukluklarda önemli bir oyuncudur. Bu nedenle, nöroinflamasyonun nörodejenerasyondaki rolünü anlamak için alternatif in vivo nöroinflamasyon modellerinin araştırılması ve geliştirilmesi büyük ilgi görmektedir. Bu çalışmada, immün yanıtı ve nörotoksisiteyi indüklemek için lipopolisakkaritin (LPS) ventriküler mikroenjeksiyonunun aracılık ettiği larva zebra balığı nöroinflamasyon modeli geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, floresan yoğunluk analizi ile entegre floresan canlı görüntüleme ile beyin nöron canlılığının gerçek zamanlı olarak ölçülmesi için kullanılmıştır. Zebra balığı larvalarının lokomotor davranışı, bir video izleme kaydedici kullanılarak otomatik olarak kaydedildi. Larva zebra balığı kafasında LPS-indüklenen immün yanıtı değerlendirmek için nitrik oksit (NO) içeriği ve interlökin-6 (IL-6), interlökin-1β (IL-1β) ve insan tümör nekroz faktör α (TNF-α) dahil olmak üzere inflamatuar sitokinlerin mRNA ekspresyon düzeyleri araştırıldı. LPS’nin beyin ventriküler enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarında nöron kaybı ve hareket eksikliği gözlendi. Ek olarak, LPS’ye bağlı nöroinflamasyon, döllenme sonrası 6 gün (dpf) zebra balığı larvalarının başında NO salınımını ve IL-6, IL-1β ve TNF-α mRNA ekspresyonunu arttırdı ve zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasıyla sonuçlandı. Bu çalışmada, zebra balıklarının LPS ile 5 dpf’de 2.5-5 mg / mL konsantrasyonda enjeksiyonu, bu farmakolojik nöroinflamasyon testi için en uygun koşul olarak belirlenmiştir. Bu protokol, bir zebra balığı larvasında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için LPS’nin beyin ventrikülü mikroenjeksiyonu için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunar; bu, nöroinflamasyonu incelemek için yararlıdır ve aynı zamanda yüksek verimli bir in vivo ilaç tarama testi olarak da kullanılabilir.

Introduction

Nöroinflamasyon, merkezi sinir sisteminin (MSS) çeşitli nörodejeneratif hastalıklarının patogenezinde rol oynayan önemli bir anti-nörojenik faktör olarak tanımlanmıştır1. Patolojik hakaretleri takiben, nöroinflamasyon, nörogenezin inhibisyonu ve nöronal hücre ölümünün indüklenmesi de dahil olmak üzere çeşitli olumsuz sonuçlara yol açabilir 2,3. Enflamasyon indüksiyonuna yanıtın altında yatan süreçte, çoklu inflamatuar sitokinler (TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi) hücre dışı boşluğa salgılanır ve nörojen ölümünde ve nörogenezin baskılanmasında çok önemli bileşenler olarak işlev görür 4,5,6.

Enflamasyon mediatörlerinin (IL-1β, L-arginin ve endotoksinler gibi) beyne mikroenjeksiyonu, nöronal hücre azalmasına ve nöroinflamasyona neden olabilir 7,8,9. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarında bulunan patojenik bir endotoksin olan lipopolisakkarit (LPS, Şekil 1), nöroinflamasyonu indükleyebilir, nörodejenerasyonu şiddetlendirebilir ve hayvanlarda nörojenezi azaltabilir10. Doğrudan fare beyninin CNS’sine LPS enjeksiyonu, nitrik oksit, pro-inflamatuar sitokinler ve diğer düzenleyicilerin seviyelerini arttırdı11. Ayrıca, LPS’nin lokal beyin ortamına stereotaksik enjeksiyonu, nörotoksik moleküllerin aşırı üretimini indükleyebilir, bu da nöronal fonksiyonun bozulmasına ve ardından nörodejeneratif hastalıkların gelişmesine neden olabilir10,12,13,14,15. Nörobilim alanında, canlı organizmalardaki hücresel ve biyolojik süreçlerin canlı ve zaman içinde mikroskobik gözlemleri, patogenezin ve farmakolojik etkinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir16. Bununla birlikte, nöroinflamasyon ve nörotoksisitenin fare modellerinin canlı görüntülenmesi, mikroskopinin sınırlı optik penetrasyon derinliği ile temel olarak sınırlıdır, bu da fonksiyonel görüntülemeyi ve gelişimsel süreçlerin canlı gözlemini engeller17,18,19. Bu nedenle, alternatif nöroinflamasyon modellerinin geliştirilmesi, patolojik gelişimin ve nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonun altında yatan mekanizmanın canlı görüntüleme ile incelenmesini kolaylaştırmak için büyük ilgi görmektedir.

Zebra balığı (Danio rerio), evrimsel olarak korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi, optik şeffaflığı, büyük embriyo debriyaj boyutu, genetik izlenebilirliği ve in vivo görüntüleme için uygunluğu nedeniyle nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonu incelemek için umut verici bir model olarak ortaya çıkmıştır19,20,21,22,23 . Önceki protokoller, LPS’yi mekanik değerlendirme olmaksızın larva zebra balıklarının yumurta sarısı ve arka beyin ventrikülüne doğrudan enjekte etmiş veya ölümcül bir sistemik bağışıklık tepkisi24,25,26,27 indüklemek için balık suyuna (kültür ortamı) LPS eklemiştir. Burada, döllenme sonrası 5 gün (dpf) zebra balığı larvalarında doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisini veya nörotoksisiteyi tetiklemek için LPS’nin beyin ventriküllerine mikroenjeksiyonu için bir protokol geliştirdik. Bu yanıt, nöronal hücre kaybı, lokomotor davranış eksikliği, artmış nitrit oksit salınımı, enflamatuar gen ekspresyonunun aktivasyonu ve enjeksiyondan 24 saat sonra zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınması ile kanıtlanmıştır.

Protocol

AB vahşi tip zebra balığı ve transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, Çin Tıp Bilimleri Enstitüsü’nden (ICMS) elde edilmiştir. Hayvan deneyleri için etik onay (UMARE-030-2017) Makao Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından verilmiş ve protokol kurumsal hayvan bakım kılavuzlarını izlemektedir. 1. Zebra balığı embriyo ve larva yetiştiriciliği Zebra balığı embriyoları (çiftleşme başı…

Representative Results

Burada açıklanan iş akışı, zebra balığı larvalarında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunmaktadır. Bu tarif edilen protokolde, 5 dpf zebra balığı, bir mikroenjektör kullanılarak beyin ventriküllerine LPS (Şekil 1) enjekte edildi (Şekil 2A-C). Beyin ventrikül bölgesine başarılı enjeksiyon% 1 Evans mavi lekesi kullanılarak doğrula…

Discussion

Epidemiyolojik ve deneysel verilerin giderek artan miktarı, kronik bakteriyel ve viral enfeksiyonları nörodejeneratif hastalıklar için olası risk faktörleri olarak göstermektedir36. Enfeksiyon, enflamatuar süreçlerin aktivasyonunu ve konakçı immün yanıtlarını tetikler37. Yanıt bir savunma mekanizması olarak hareket etse bile, aşırı aktive inflamasyon nörogeneze zararlıdır ve enflamatuar ortam yenidoğan nöronlarının hayatta kalmasına izin vermez<…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Makao ÖİB Bilim ve Teknoloji Geliştirme Fonu’ndan (FDCT) gelen hibelerle desteklenmiştir (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 ve 0016/2019/AKP), Araştırma Komitesi, Makao Üniversitesi (MYRG2020-00183-ICMS ve CPG2022-00023-ICMS) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

タグ

Brain VentricleMicroinjectionLipopolysaccharideNeuroinflammationNeurotoxicityZebrafishIn Vivo ModelAnti-neuroinflammatory DrugsGlass CapillaryMicromanipulatorAgaroseAnesthesia

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image