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Abstract
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神経科学

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

概要

Este protocolo demuestra la microinyección de lipopolisacárido en la región ventricular cerebral en un modelo larvario de pez cebra para estudiar la respuesta neuroinflamatoria resultante y la neurotoxicidad.

Abstract

La neuroinflamación es un jugador clave en diversos trastornos neurológicos, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es de gran interés investigar y desarrollar modelos alternativos de neuroinflamación in vivo para comprender el papel de la neuroinflamación en la neurodegeneración. En este estudio, se desarrolló y validó un modelo larval de pez cebra de neuroinflamación mediado por microinyección ventricular de lipopolisacárido (LPS) para inducir una respuesta inmune y neurotoxicidad. Las líneas transgénicas de pez cebra elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se utilizaron para la cuantificación en tiempo real de la viabilidad de las neuronas cerebrales mediante imágenes fluorescentes en vivo integradas con análisis de intensidad de fluorescencia. El comportamiento locomotor de las larvas de pez cebra se registró automáticamente utilizando una grabadora de seguimiento de video. Se investigó el contenido de óxido nítrico (NO) y los niveles de expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias, incluyendo interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral humana α (TNF-α) para evaluar la respuesta inmune inducida por LPS en la cabeza larval del pez cebra. A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral de LPS, se observó pérdida de neuronas y deficiencia de locomoción en larvas de pez cebra. Además, la neuroinflamación inducida por LPS aumentó la liberación de NO y la expresión de ARNm de IL-6, IL-1β y TNF-α en la cabeza de larvas de pez cebra de 6 días después de la fertilización (dpf), y resultó en el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra. En este estudio, la inyección de pez cebra con LPS a una concentración de 2.5-5 mg / ml a 5 dpf se determinó como la condición óptima para este ensayo de neuroinflamación farmacológica. Este protocolo presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para la microinyección de LPS en el ventrículo cerebral para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en una larva de pez cebra, que es útil para estudiar la neuroinflamación y también podría usarse como un ensayo de detección de drogas in vivo de alto rendimiento.

Introduction

La neuroinflamación ha sido descrita como un factor antineurogénico crucial implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central (SNC)1. Después de los insultos patológicos, la neuroinflamación puede resultar en diversas consecuencias adversas, incluyendo la inhibición de la neurogénesis y la inducción de la muerte celular neuronal 2,3. En el proceso subyacente a la respuesta a la inducción de inflamación, múltiples citoquinas inflamatorias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) son secretadas en el espacio extracelular y actúan como componentes cruciales en la muerte neuronal y la supresión de la neurogénesis 4,5,6.

La microinyección de mediadores de la inflamación (como IL-1β, L-arginina y endotoxinas) en el cerebro puede causar reducción de células neuronales y neuroinflamación 7,8,9. El lipopolisacárido (LPS, Figura 1), una endotoxina patógena presente en la pared celular de las bacterias gramnegativas, puede inducir neuroinflamación, exacerbar la neurodegeneración y reducir la neurogénesis en animales10. La inyección de LPS directamente en el SNC del cerebro del ratón aumentó los niveles de óxido nítrico, citoquinas proinflamatorias y otros reguladores11. Además, la inyección estereotáxica de LPS en el entorno cerebral local puede inducir una producción excesiva de moléculas neurotóxicas, lo que resulta en una función neuronal deteriorada y el posterior desarrollo de enfermedades neurodegenerativas 10,12,13,14,15. En el campo de la neurociencia, las observaciones microscópicas vivas y temporales-curso de los procesos celulares y biológicos en organismos vivos son cruciales para comprender los mecanismos subyacentes a la patogénesis y la acción farmacológica16. Sin embargo, la imagen en vivo de modelos de ratón de neuroinflamación y neurotoxicidad está fundamentalmente limitada por la limitada profundidad de penetración óptica de la microscopía, lo que impide la imagen funcional y la observación en vivo de los procesos de desarrollo17,18,19. Por lo tanto, el desarrollo de modelos alternativos de neuroinflamación es de gran interés para facilitar el estudio del desarrollo patológico, y el mecanismo subyacente a la neuroinflamación y la neurodegeneración, mediante imágenes en vivo.

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo prometedor para estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración debido a su sistema inmune innato conservado evolutivamente, transparencia óptica, gran tamaño de embrague embrionario, trazabilidad genética e idoneidad para imágenes in vivo 19,20,21,22,23 . Los protocolos anteriores han inyectado directamente LPS en la yema y el ventrículo del cerebro posterior de larvas de pez cebra sin evaluación mecanicista, o simplemente han agregado LPS al agua de los peces (medio de cultivo) para inducir una respuesta inmune sistémica letal24,25,26,27. Aquí, desarrollamos un protocolo para la microinyección de LPS en los ventrículos cerebrales, para desencadenar una respuesta inmune innata o neurotoxicidad en los 5 días posteriores a la fertilización (dpf) de larvas de pez cebra. Esta respuesta se evidencia por la pérdida de células neuronales, el déficit de comportamiento locomotor, el aumento de la liberación de óxido de nitrito, la activación de la expresión génica inflamatoria y el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra a las 24 h después de la inyección.

Protocol

Las líneas de pez cebra de tipo salvaje AB y pez cebra transgénico elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas Chinas (ICMS). La aprobación ética (UMARE-030-2017) para los experimentos con animales fue otorgada por el Comité de Ética de Investigación Animal de la Universidad de Macao, y el protocolo sigue las pautas institucionales de cuidado animal. 1. Cría de embriones y larvas de pez cebra Generar embriones de…

Representative Results

El flujo de trabajo descrito aquí presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en larvas de pez cebra. En este protocolo descrito, se inyectaron 5 dpf de pez cebra con LPS (Figura 1) en ventrículos cerebrales utilizando un microinyector (Figura 2A-C). La inyección exitosa en el sitio del ventrículo cerebral se verificó utilizando tinción azul de Evans …

Discussion

Una cantidad creciente de datos epidemiológicos y experimentales implican infecciones bacterianas y virales crónicas como posibles factores de riesgo para enfermedades neurodegenerativas36. La infección desencadena la activación de procesos inflamatorios y respuestas inmunes del huésped37. Incluso si la respuesta actúa como un mecanismo de defensa, la inflamación sobreactivada es perjudicial para la neurogénesis, y el ambiente inflamatorio no permite la supervivenci…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (FDCT) de la RAE de Macao (Ref. FDCT0058/2019/A1 y 0016/2019/AKP), Comité de Investigación, Universidad de Macao (MYRG2020-00183-ICMS y CPG2022-00023-ICMS), y Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
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参考文献

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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
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