JoVE Journal > Neuroscience
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神経科学

Микроинъекции желудочков головного мозга липополисахарида в личинок рыбок данио для оценки нейровоспаления и нейротоксичности

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

概要

Этот протокол демонстрирует микроинъекцию липополисахарида в желудочковую область мозга в модели личинок рыбок данио для изучения результирующей нейровоспалительной реакции и нейротоксичности.

Abstract

Нейровоспаление является ключевым игроком в различных неврологических расстройствах, включая нейродегенеративные заболевания. Поэтому большой интерес представляют исследования и разработка альтернативных моделей нейрововоспаления in vivo для понимания роли нейровоспаления в нейродегенерации. В этом исследовании была разработана и подтверждена модель нейровоспаления личиночной рыбки данио, опосредованной желудочковой микроинъекцией липополисахарида (ЛПС) для индуцирования иммунного ответа и нейротоксичности. Трансгенные линии рыбок данио elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP и mpo:EGFP использовались для количественной оценки жизнеспособности нейронов мозга в режиме реального времени с помощью флуоресцентной живой визуализации, интегрированной с анализом интенсивности флуоресценции. Локомоторное поведение личинок рыбок данио было записано автоматически с помощью видеорегистратора. Содержание оксида азота (NO) и уровни экспрессии мРНК воспалительных цитокинов, включая интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли человека α (TNF-α), были исследованы для оценки вызванного ЛПС иммунного ответа в голове личинок рыбок данио. Через 24 ч после желудочковой инъекции ЛПС в мозг у личинок рыбок данио наблюдалась потеря нейронов и дефицит локомоции. Кроме того, вызванное ЛПС нейровоспаление увеличивало высвобождение NO и экспрессию мРНК IL-6, IL-1β и TNF-α в голове в течение 6 дней после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио и приводило к набору нейтрофилов в мозг рыбок данио. В этом исследовании инъекция рыбок данио с ЛПС в концентрации 2,5-5 мг/мл при 5 dpf была определена как оптимальное условие для этого фармакологического нейровоспаленного анализа. Этот протокол представляет собой новую, быструю и эффективную методологию микроинъекции ЛПС в желудочек головного мозга для индуцирования ЛПС-опосредованного нейровоспаления и нейротоксичности у личинки рыбок данио, которая полезна для изучения нейровоспаления, а также может быть использована в качестве высокопроизводительного анализа лекарств in vivo .

Introduction

Нейровоспаление было описано как важнейший антинейрогенный фактор, участвующий в патогенезе ряда нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС)1. После патологических инсультов нейровоспаление может привести к различным неблагоприятным последствиям, включая ингибирование нейрогенеза и индукцию гибели нейрональных клеток 2,3. В процессе, лежащем в основе реакции на индукцию воспаления, множественные воспалительные цитокины (такие как TNF-α, IL-1β и IL-6) секретируются во внеклеточное пространство и действуют как важнейшие компоненты в гибели нейронов и подавлении нейрогенеза 4,5,6.

Микроинъекция медиаторов воспаления (таких как IL-1β, L-аргинин и эндотоксины) в мозг может вызвать сокращение нейрональных клеток и нейровоспаление 7,8,9. Липополисахарид (ЛПС, рисунок 1), патогенный эндотоксин, присутствующий в клеточной стенке грамотрицательных бактерий, может вызывать нейровоспаление, усугублять нейродегенерацию и уменьшать нейрогенез у животных10. Инъекция ЛПС непосредственно в ЦНС мозга мыши повышала уровень оксида азота, провоспалительных цитокинов и других регуляторов11. Кроме того, стереотаксическая инъекция ЛПС в локальную среду мозга может индуцировать чрезмерную выработку нейротоксических молекул, что приводит к нарушению функции нейронов и последующему развитию нейродегенеративных заболеваний 10,12,13,14,15. В области неврологии микроскопические наблюдения за клеточными и биологическими процессами в живых организмах имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в основе патогенеза и фармакологического действия16. Однако живая визуализация мышиных моделей нейровоспаления и нейротоксичности принципиально ограничена ограниченной глубиной оптического проникновения микроскопии, что исключает функциональную визуализацию и живое наблюдение за процессами развития 17,18,19. Поэтому разработка альтернативных моделей нейровоспаления представляет большой интерес для облегчения изучения патологического развития и механизма, лежащего в основе нейровоспаления и нейродегенерации, с помощью живой визуализации.

Рыбка данио (Danio rerio) стала многообещающей моделью для изучения нейровоспаления и нейродегенерации благодаря своей эволюционно сохраненной врожденной иммунной системе, оптической прозрачности, большому размеру кладки эмбрионов, генетической управляемости и пригодности для визуализации in vivo 19,20,21,22,23 . Предыдущие протоколы либо непосредственно вводили ЛПС в желток и желудочек заднего мозга личинок рыбок данио без механистической оценки, либо просто добавляли ЛПС в рыбью воду (культуральную среду), чтобы вызвать смертельный системный иммунный ответ 24,25,26,27. Здесь мы разработали протокол для микроинъекции ЛПС в желудочки мозга, чтобы вызвать врожденный иммунный ответ или нейротоксичность в течение 5 дней после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио. Эта реакция подтверждается потерей нейрональных клеток, дефицитом локомоторного поведения, повышенным высвобождением оксида нитритов, активацией экспрессии воспалительных генов и набором нейтрофилов в мозг рыбок данио через 24 ч после инъекции.

Protocol

Ab диких рыбок данио и трансгенных линий рыбок данио elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP и mpo: EGFP были получены из Института китайских медицинских наук (ICMS). Этическое одобрение (UMARE-030-2017) для экспериментов на животных было предоставлено Комитетом по этике исследований животных Университета Макао, и протоко?…

Representative Results

Описанный здесь рабочий процесс представляет собой новую, быструю и эффективную методологию индуцирования ЛПС-опосредованного нейровоспаления и нейротоксичности у личинок рыбок данио. В этом описанном протоколе 5 dpf рыбок данио вводили с ЛПС (рисунок 1) в желудочки моз?…

Discussion

Все больше эпидемиологических и экспериментальных данных указывают на хронические бактериальные и вирусные инфекции в качестве возможных факторов риска нейродегенеративных заболеваний36. Инфекция запускает активацию воспалительных процессов и иммунных реакций хозяин?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами Фонда развития науки и техники (FDCT) САР Макао (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 и 0016/2019/AKP), Исследовательский комитет Университета Макао (MYRG2020-00183-ICMS и CPG2022-00023-ICMS) и Национальный фонд естественных наук Китая (No 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

タグ

Brain VentricleMicroinjectionLipopolysaccharideNeuroinflammationNeurotoxicityZebrafishIn Vivo ModelAnti-neuroinflammatory DrugsGlass CapillaryMicromanipulatorAgaroseAnesthesia

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image