הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

מערכת החיסון המולדת פועלת כקו ההגנה הראשון במהלך זיהום ובתגובה לגירויים סטריליים, כגון פגיעה ברקמות ושינויים בהומאוסטזיס. חיישנים חיסוניים מולדים על פני התא ובציטופלסמה מגיבים לדפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן או נזק (PAMPs או DAMPs, בהתאמה) כדי להפעיל מסלולי איתות דלקתיים ותגובות תאיות. אחד התהליכים המרכזיים של התגובה החיסונית המולדת הוא השראת מוות תאי כדי להסיר תאים נגועים או פגומים ולהניע תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות נוספות. מוות תאי מתוכנת (PCD) הוא תהליך שמור מאוד בין מינים, מה שמדגיש את חשיבותו האבולוציונית כמנגנון חיסוני מולד.

ישנם מספר מסלולי PCD חיסוניים מולדים שיכולים להיות מופעלים בכל סוגי התאים. קספזות הן משפחת מפתח של פרוטאזות תלויות ציסטאין שהשתמרו מאוד, תוך תאיות ותלויות ציסטאין, שהן קריטיות במסלולי PCD רבים, כולל מסלול אפופטוזיס לא דלקתי מסורתי, כמו גם מסלולי PCD דלקתיים כמו פירופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis ^1,2,3,4,5 . ישנם 11 קספזות אנושיות ו -10 קספזות מורין המוגדרות היטב, כמו גם פסאודו-קספזות שעשויות להיות פונקציונליות, ורובן מבוטאות באופן מכונן כפרו-קספזות מונומריות או דימריות לא פעילות הדורשות מחשוף להפעלה ^6,7. Caspases מכילים גם תחומים חשובים עבור גיוס והיווצרות של מתחמי multiprotein. אלה כוללים את תחום ההפעלה והגיוס של קספאז (CARD), שניתן למצוא בקספאז-1, קספאז-2, קספאז-4, קספאז-5, קספאז-9 וקספאז-11, או תחום אפקט המוות (DED), שנמצא בקספאז-8 ובקספאז-10. הן באמצעות הפעילות הפרוטאוליטית שלהם והן באמצעות יכולתם ליצור קומפלקסים של מולטי-חלבונים, קספזות הן מניעים קריטיים של PCD חיסוני מולד.

תפקידן של קספזות ב-PCD של מערכת החיסון המולדת זוהה לראשונה באפופטוזיס, כאשר הקספזות היוזמות, קספאז-2, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-10, מפעילות את קספזות התליינים, קספאז-3, קספאז-6 וקספאז-7, כדי לגרום למוות תאי 8,9,10,11,12. קספזות יוזמות יכולות להיות מופעלות על ידי מפל איתות מגוון; המסלול החיצוני מפעיל את קספאז-8 באמצעות איתות קולטן מוות חוץ-תאי המושרה על ידי ליגנד, והמסלול הפנימי מפעיל את קספאז-9 באמצעות הפרעה לשלמות המיטוכונדריה¹³. קספזות יוזמות מופעלות מנתקות את המקשר המפריד בין תת-היחידות הקטליטיות הגדולות והקטנות של קספזות התליין כדי לייצר את צורתן הפעילה. לאחר מכן, קספזות התליין קורעות את הסובסטרטים שלהן כדי לפרק את התא, וכתוצאה מכך מתפרקת הדנ”א, ממברנות מפוצלות, פיצול גרעיני ושחרור גופים אפופטוטיים^14,15. תהליך זה מסתיים בדרך כלל בצורה לא ליטית ולא דלקתית של מוות תאי כאשר הוא יחד עם פינוי מיידי של התאים הגוססים על ידי אפרוציטוזה¹⁶. עם זאת, פגמים efferocytosis או חוסר תאים phagocytic יכול להוביל הצטברות של תאים אפופטוטיים, אשר לאחר מכן לעבור מוות תאים ליטיים ודלקתיים^17,18.

הקספזות הדלקתיות, כולל קספאז-1 (אדם ועכבר), קספאז-4 וקספאז-5 (אדם) וקספאז-11 (עכבר), התגלו כמופעלות במהלך צורה של PCD (III-PCD) דלקתי של מערכת החיסון המולדת הנקראת פירופטוזיס. הפעלת קספאז-1 קשורה להיווצרות של דלקתיות, שהן קומפלקסים רב-חלבוניים המכילים חיישן חיסוני מולד ציטוסולי, מולקולת מתאם (חלבון דמוי גרגיר הקשור לאפופטוזיס המכיל CARD [ASC]) וקספאז-1. היווצרות קומפלקס זה מאפשרת לקספאז-1 לעבור אוטופרוטאוליזה בתיווך קרבה כדי לשחרר את צורתו הפעילה, אשר יכולה לבקע את מצעי המטרה כולל הציטוקינים מעודדי הדלקת אינטרלוקין (IL)-1β ו- IL-18 ומולקולה יוצרת הנקבוביות Gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . קספאז-11, קספאז-4 וקספאז-5 יכולים גם להפעיל GSDMD ללא היווצרות מעלה הזרם של הדלקתיות לאחר חישה של PAMPs כגון ליפופוליסכריד (LPS)^19,20. קספזות אלה עוברות דימריזציה ואחריה אוליגומריזציה ומחשוף עצמי להפעלה עם קשירה ל- LPS ציטוסולי, מה שמוביל להפעלה דלקתית לא קנונית 24,25,26 והפעלת קספאז-1 באופן פנימי לתאים כדי לגרום להבשלת IL-1β ו- IL-18 ²⁰. ההבשלה והשחרור של ציטוקינים מעודדי דלקת אלה מאפיינים קספזות אלה כ”דלקתיות”. בנוסף, נמצא כי הקספאז-8 האפופטוטי מתמקם בדלקת, ומספק קשר בין תהליכים אפופטוטיים ופירופטוטיים. מחקרים מצאו כי קספאז-8 אפופטוטי הוא גם קריטי לוויסות צורה אחרת של PCD הנקראת נקרופטוזיס. אובדן קספאז-8 גורם לאינטראקציה ספונטנית של קולטן סרין-תראונין קינאז 3 (RIPK3) בתיווך שושלת מעורבת קינאז דמוי תחום פסאודוקינאז (MLKL) כדי להניע את מסלול III-PCD של נקרופטוזיס 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

בעוד שקספזות סווגו בעבר כ”אפופטוטיות” או “דלקתיות” בהתבסס על סוג המוות התאי שהן יוזמות, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שיש הצלבה נרחבת בין מסלולי PCD של מערכת החיסון המולדת דרך קספזות ^3,4. לדוגמה, הקספאז-1 הדלקתי מדלקת קוטע את הקספאז-7 האפופטוטי באתר ההפעלה הקנוני שלו³⁴. הפעלת קספאז-1 יכולה גם להוביל לפיצול של מצעים אפופטוטיים כגון פולי(ADP-ריבוז) פולימראז 1 (PARP1)³⁶. בתאים חסרי GSDMD, קספאז-1 יכול גם לבקע קספאז-3^37,38. בנוסף, קספאז-3 אפופטוטי קנוני יכול לבקע gasdermin E (GSDME) כדי לגרום PCD^17,18 וגם מעבד GSDMD לתוך צורה^{לא פעילה 40}. יתר על כן, גיוס קספאז-8 לקומפלקס הדלקתי נצפה 39,40,41,42,43,44,45^, וקספאז-8 הוא וסת מרכזי של הפעלה דלקתית קנונית ולא קנונית ³⁹. ישנם גם תפקידים חופפים ומיותרים עבור קספאז-8 וקספאז-1 במצבים דלקתיים רבים, ו-PCD חיסוני מולד המאופיין בהפעלת רכיבים פירופטוטיים, אפופטוטיים ונקרופטוטיים, מתרחש על פני ספקטרום המחלה 39,46,47,48,49,50.

בהתבסס על קשר גומלין זה בין קספזות דלקתיות ואפופטוטיות, זוהה פער מרכזי בהבנה המכניסטית של חסינות מולדת ו- PCD, מה שהוביל לגילוי PANoptosis. PANoptosis היא צורה ייחודית של III-PCD המופעלת בתגובה לפתוגנים, PAMPs, DAMPs ושינויים בהומאוסטזיס ומווסתת על ידי PANoptosomes – קומפלקסים מקרומולקולריים רבגוניים המשלבים רכיבים ממסלולי מוות תאי אחרים 44,50,51,52,53,54,55 . מכלול ההשפעות הביולוגיות ב-PANoptosis אינו יכול להיות מוסבר באופן אינדיבידואלי על ידי פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס בלבד 3,4,35,36,39,46,47,48, שכן PANoptosis מאופיין בהפעלה של קספזות מרובות, כולל קספאז-1, קספאז-11^, קספאז-8, קספאז-9, קספאז-3 ו/או קספאז-7^, בהתאם להקשר 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptosis היה מעורב יותר ויותר במחלות זיהומיות ודלקתיות, כמו גם בסרטן וטיפולים בסרטן 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66^.

בהתחשב בתפקיד החיוני של קספזות על פני מסלולי מוות תאי, כולל אפופטוזיס, פירופטוזיס, נקרופטוזיס, ו PANoptosis, חשוב לפתח טכניקות כדי לאפיין את ההפעלה שלהם ולהבין את המורכבות המלאה של מסלולי PCD. הפרוטוקול כאן מפרט שיטה לגרות תאים ולמדוד את ההפעלה הבאה של קספזות (איור 1). שיטה זו ממנפת את המחשוף הפרוטאוליטי של קספזות, הנדרש בדרך כלל להפעלתן, כאמצעי לחקור אותן. באמצעות כתמים מערביים, ניתן לקבוע את גודל החלבון, המאפשר הדמיה ברורה והתמיינות של פרו-קספזות לא פעילות וצורתן הפעילה והשסועה.

היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם: 1) יכולתו להעריך את ההפעלה של מספר קספזות במקביל מאוכלוסייה אחת של תאים אנדוגניים כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר את הפעלת PCD, 2) שימוש בטכניקות מעבדה פשוטות יחסית שאינן דורשות הכשרה מקיפה או ציוד יקר. פרוטוקולים קודמים השתמשו בכתם מערבי, בכתבים פלואורסצנטיים או בצביעת נוגדנים כדי לעקוב אחר הפעלת קספז בתרביות, בליזטים של תאים ורקמות, בתאים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה, וב-in vivo 67,68,69,70,71^, אך טכניקות אלה בדרך כלל מנטרות רק קספזה אחת או שתיים בדגימה. יתר על כן, בעוד שמצעים פפטידים סינתטיים המכילים אתרי מחשוף קספז הזורמים על המחשוף שימשו לניטור הפעלת קספז בליזטים של תאים או רקמות⁶⁹, מצעים אלה יכולים לעתים קרובות להיבקע על ידי יותר מקספזה אחת, מה שמקשה לקבוע את ההפעלה הספציפית של קספזות בודדות במערכת זו. בנוסף, השימוש בכתם מערבי במקום שימוש בכתבים פלואורסצנטיים או שיטות מבוססות תגיות אחרות מאפשר לחוקרים להשתמש בתאים אנדוגניים במקום ליצור קווי תאים ספציפיים עם גנים של כתב. ישנם יתרונות רבים לשימוש בתאים אנדוגניים, כולל העובדה שקווי תאים אימורטליים רבים חסרים במולקולות מפתח של מוות תאי^72,73, מה שעלול להשפיע על התוצאות. בנוסף, שימוש בתאים אנדוגניים מאפשר הערכה של סוגי תאים מגוונים, כגון מקרופאגים, תאי אפיתל ותאי אנדותל, ולא שושלת אחת. המלטות מערביות הן גם טכניקה פשוטה יחסית וחסכונית שניתן לבצע במעבדות ברחבי העולם ללא צורך בציוד גדול ויקר או התקנות מסובכות.

פרוטוקול זה מיושם באופן נרחב ברחבי הביולוגיה כדי להבין הן את התפקודים התלויים במוות תאי והן את התפקודים שאינם תלויים במוות תאי של קספזות, כולל תפקידי הפיגומים שלהם ותפקודם במסלולי איתות דלקתיים אחרים⁷⁴. יישום שיטה זו מאפשר גישה אחידה בחקר מסלולי PCD חיסוניים מולדים ואיתות דלקתי על פני מחלות ותנאים, וניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות תהליכים רגולטוריים קריטיים וקשרים מכניסטיים שיסייעו בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.