הכנה, מאפיינים, רעילות והערכת יעילות של החיסון לגידול ננו-תחליב באף בהרכבה עצמית במבחנה וב-Vivo
概要
כאן, אנו מציגים שיטות מפורטות להכנה והערכה של החיסון לגידול ננו-תחליב בהרכבה עצמית באף במבחנה ו-in vivo.
Abstract
פפטידים אפיטופיים משכו תשומת לב נרחבת בתחום חיסוני הגידול בגלל בטיחותם, ספציפיות גבוהה וייצור נוח; בפרט, כמה אפיטופים מוגבלים MHC I יכולים לגרום לפעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים T יעילה כדי לנקות תאים סרטניים. בנוסף, מתן אף הוא טכניקת מסירה יעילה ובטוחה לחיסונים לגידולים בשל הנוחות שלה והיענות משופרת למטופלים. עם זאת, פפטידים אפיטופיים אינם מתאימים לאספקת האף בגלל האימונוגניות הירודה שלהם וחוסר יעילות ההעברה. ננו-תחליבים (NEs) הם מערכות יציבות מבחינה תרמודינמית שניתן לטעון באנטיגנים ולהעביר ישירות לפני השטח של רירית האף. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) הוא פנטפפטיד הליבה של למינין, פפטיד קושר אינטגרין המתבטא על ידי תאי אפיתל נשימתיים אנושיים. במחקר זה, חיסון לגידול אפיטופ פפטיד NE בהרכבה עצמית תוך אפי המכיל את הפפטיד הסינתטי IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) הוכן בשיטת תחליב באנרגיה נמוכה. השילוב של IKVAV ו- OVA257-264 יכול לשפר את ספיגת האנטיגן על ידי תאי אפיתל ברירית האף. כאן, אנו קובעים פרוטוקול לחקר המאפיינים הפיזיקוכימיים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM), מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ופיזור אור דינמי (DLS); יציבות בנוכחות חלבון מוצין; רעילות על ידי בחינת יכולת הקיום התאית של תאי BEAS-2B ורקמות האף והריאות של עכברי C57BL/6; קליטה סלולרית על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM); לשחרר פרופילים על ידי הדמיה של חיות קטנות in vivo; וההשפעה המגנה והטיפולית של החיסון באמצעות מודל נושא גידול E.G7. אנו צופים כי הפרוטוקול יספק רמזים טכניים ותיאורטיים לפיתוח עתידי של חיסונים ריריים חדשניים מסוג תאי T אפיטופים פפטידיים.
Introduction
כאחד החידושים הקריטיים ביותר בתחום בריאות הציבור, חיסונים ממלאים תפקיד מפתח במאבק בנטל העולמי של מחלות אנושיות1. כך למשל, בימים אלה נבדקים למעלה מ-120 חיסונים מועמדים לקורונה, חלקם אושרו במדינות רבות2. דיווחים אחרונים קובעים כי חיסונים נגד סרטן שיפרו ביעילות את התקדמות הטיפולים הקליניים בסרטן מכיוון שהם מכוונים את המערכת החיסונית של חולי סרטן לזהות אנטיגנים כזרים לגוף3. יתר על כן, אפיטופים מרובים של תאי T הממוקמים בתוך או מחוץ לתאי הגידול יכולים לשמש לתכנון חיסונים פפטידיים, אשר הראו יתרונות בטיפול בסרטן גרורתי בגלל היעדר הרעילות המשמעותית הקשורה להקרנות וכימותרפיה 4,5. מאז אמצע שנות התשעים נערכו ניסויים פרה-קליניים וקליניים לטיפול בגידולים בעיקר באמצעות חיסונים נגד פפטידי אנטיגן, אך מעטים החיסונים המציגים השפעה טיפולית מספקת על חולי סרטן6. יתר על כן, חיסונים לסרטן עם אפיטופים פפטידים הם בעלי אימונוגניות ירודה ויעילות אספקה לא מספקת, אשר עשויה לנבוע מהתפרקות מהירה של פפטידים חוץ-תאיים המתפזרים במהירות ממקום הנתינה, מה שמוביל לספיגת אנטיגן לא מספקת על ידי תאי החיסון7. לכן, יש צורך להתגבר על מכשולים אלה עם טכנולוגיית משלוח חיסונים.
OVA 257-264, אפיטופ MHC Class I-binding257-264 מבוטא כחלבון היתוך, הוא אפיטופ מודל8 הנמצא בשימוש תכוף. בנוסף, OVA257-264 חיוני לתגובה החיסונית הנרכשת נגד גידולים, אשר תלויה בתגובת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL). הוא מתווך על ידי תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בגידול, המושרים על ידי פפטיד OVA257-264 . הוא מאופיין על ידי גרנים B מספיק, אשר משוחרר על ידי תאי T ציטוטוקסיים, המוביל אפופטוזיס של תאי המטרה8. עם זאת, מתן פפטידי OVA257-264 חופשי עשוי לגרום לפעילות CTL מועטה מכיוון שהספיגה של אנטיגנים אלה מתרחשת בתאים לא ספציפיים ולא בתאים מציגי אנטיגן (APC). מחסור בגירוי חיסוני מתאים גורם לפעילות CTL5. לכן, השראת פעילות CTL יעילה דורשת התקדמות ניכרת.
בשל המחסום המסופק על ידי תאי אפיתל והפרשת ריר מתמשכת, אנטיגנים חיסוניים מוסרים במהירות מרירית האף 9,10. פיתוח וקטור חיסון יעיל שיכול לעבור דרך הרקמה הרירית הוא חיוני מכיוון שהתאים מציגי האנטיגן ממוקמים מתחת לאפיתל הרירית9. הזרקה תוך אפית של חיסונים גורמת תיאורטית לחסינות רירית להילחם בזיהום רירית11. בנוסף, מתן האף הוא שיטת מתן יעילה ובטוחה לחיסונים בשל הנוחות שלה, הימנעות ממתן מעיים ושיפור היענות המטופל7. לכן, אספקת האף היא אמצעי טוב למתן ננו-חיסון אפיטופ פפטידי חדש.
מספר ביו-חומרים סינתטיים פותחו כדי לשלב אפיטופים של אינטראקציות בין רקמת התא לתא. חלבונים ביו-אקטיביים מסוימים, כגון Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), הוכנסו כחלק ממבנה ההידרוג’ל כדי להעניק פעילות ביולוגית12. פפטיד זה תורם ככל הנראה להיקשרות, נדידה וצמיחה של תאים13 וקושר אינטגרינים α-3β1ו-α-6β1 כדי לקיים אינטראקציה עם סוגי תאים סרטניים שונים. IKVAV הוא פפטיד היצמדות תאים הנגזר מחלבון קרום מרתף למינין α שרשרת1 ששימש במקור למדל את המיקרו-סביבה העצבית ולגרום להתמיינות עצבית14. לכן, מציאת רכב משלוח יעיל לחיסון חדשני זה חשובה לבקרת מחלות.
מערכות תחליב שדווחו לאחרונה, כגון W805EC ו- MF59, הורכבו גם עבור אספקת חלל האף של חיסון שפעת מומת או אנטיגן משטח רקומביננטי של הפטיטיס B והודגמו כמעוררות חסינות רירית ומערכתית15. לננו-תחליבים (NEs) יש את היתרונות של ניהול קל וקופורמציה נוחה עם אדג’ובנטים יעילים בהשוואה למערכות העברת רירית חלקיקים16. חיסוני ננו-תחליב דווחו כמשנים את הפנוטיפ האלרגי באופן מתמשך שונה מדסנסיטיזציה מסורתית, המביאה להשפעות דיכוי ארוכות טווח17. אחרים דיווחו כי ננו-תחליבים בשילוב עם אנטיגנים אימונודומיננטיים ספציפיים ל-Mtb יכולים לגרום לתגובות חזקות של תאי רירית ולהעניק הגנה משמעותית18. לכן, תוכנן ננו-חיסון חדשני בהרכבה עצמית תוך אפית עם הפפטיד הסינתטי IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, הפפטיד המורכב מ- IKVAV הקשור ל- OVA257-264). חשוב להעריך ננו-חיסון חדשני זה באופן שיטתי.
מטרת פרוטוקול זה היא להעריך באופן שיטתי את המאפיינים הפיזיקוכימיים, הרעילות והיציבות של הננו-חיסון, לזהות אם ספיגת האנטיגן וההשפעות המגינות והטיפוליות משופרות באמצעים טכניים, ולפרט את תכני הניסוי העיקריים. במחקר זה, ביססנו סדרה של פרוטוקולים לחקר המאפיינים הפיזיקוכימיים והיציבות, לקבוע את עוצמת הרעילות של תאי I-OVA NE עד BEAS-2B על ידי CCK-8, ולבחון את יכולת הצגת האנטיגן של תאי BEAS-2B לחיסון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, להעריך את פרופילי השחרור של ננו-חיסון חדשני זה in vivo ו-in vitroולזהות את ההשפעה המגנה והטיפולית של חיסון זה באמצעות מודל עכבר נושא גידול E.G7-OVA.,
Protocol
Representative Results
Discussion
לננו-חיסונים המתפקדים עם קרומי אימונוציטים יש יתרונות גדולים בטיפול ממוקד מחלה, ותופעות הלוואי ממוזערות על ידי תכונות כגון טרופיזם גידולי ייחודי, זיהוי מטרות ספציפיות, זרימת דם ממושכת, אינטראקציות בין-תאיות משופרות ורעילות מערכתית נמוכה. הם יכולים גם להיות משולבים בקלות עם מודולי טיפול ?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מס ‘31670938, 32070924, 32000651 של תוכנית הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מס ‘2014jcyjA0107 ומס ‘2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ’ונגצ’ינג, מס ‘2020XBK24 ומס ‘2020XBK26 של האוניברסיטה הרפואית הצבאית פרויקטים מיוחדים, ומס ‘202090031021 ומס ‘202090031035 של התוכנית הלאומית לחדשנות ויזמות לתלמידי מכללות.
Materials
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
参考文献
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
- Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
- Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
- Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
- Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
- Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
- Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
- Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
- Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
- Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
- Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
- Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
- Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
- Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
- Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
- O’Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
- Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
- Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
- Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis – A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
- George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
- Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. , (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
- Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O’Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
- Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
- Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
- Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).
