Identificare le caspasi e i loro motivi che scindono le proteine durante l'infezione da virus dell'influenza A
概要
L’infezione da virus dell’influenza A (IAV) attiva le caspasi che scindono le proteine dell’ospite e virali, che, a loro volta, hanno funzioni pro e antivirali. Utilizzando inibitori, interferenza dell’RNA, mutagenesi sito-diretta e tecniche di western blotting e RT-qPCR, sono state identificate caspasi in cellule di mammifero infette che scindono la cortactina ospite e le deacetilasi istoniche.
Abstract
Le caspasi, una famiglia di proteasi della cisteina, orchestrano la morte cellulare programmata in risposta a vari stimoli, comprese le infezioni microbiche. Inizialmente descritta per verificarsi per apoptosi, la morte cellulare programmata è ora nota per comprendere tre percorsi interconnessi: piroptosi, apoptosi e necroptosi, insieme coniati come un unico processo, PANoptosis. L’infezione da virus Influenza A (IAV) induce la PANoptosi nelle cellule di mammifero inducendo l’attivazione di diverse caspasi, che, a loro volta, scindono varie proteine dell’ospite e virali, portando a processi come l’attivazione della risposta antivirale innata dell’ospite o la degradazione delle proteine antagoniste dell’ospite. A questo proposito, la scissione mediata dalla caspasi 3 della cortactina ospite, dell’istone deacetilasi 4 (HDAC4) e dell’istone deacetilasi 6 (HDAC6) è stata scoperta in cellule epiteliali sia animali che umane in risposta all’infezione da IAV. Per dimostrare ciò, sono stati impiegati inibitori, interferenze dell’RNA e mutagenesi diretta al sito e, successivamente, la scissione o resistenza alla scissione e il recupero dei polipeptidi cortactina, HDAC4 e HDAC6 sono stati misurati mediante western blotting. Questi metodi, in combinazione con RT-qPCR, formano una strategia semplice ma efficace per identificare l’ospite e le proteine virali che subiscono la scissione mediata dalla caspasi durante un’infezione di IAV o altri virus umani e animali. Il presente protocollo elabora i risultati rappresentativi di questa strategia e vengono anche discussi i modi per renderla più efficace.
Introduction
Il virus dell’influenza A (IAV) è il membro prototipo della famiglia Orthomyxoviridae ed è noto per causare epidemie globali e pandemie imprevedibili. IAV causa malattie respiratorie umane, influenza, comunemente noto come “influenza”. L’influenza è una malattia acuta che provoca l’induzione di risposte immunitarie innate pro- e anti-infiammatorie dell’ospite e la morte delle cellule epiteliali nel tratto respiratorio umano. Entrambi i processi sono governati da un fenomeno chiamato morte cellulare programmata1. La segnalazione per la morte cellulare programmata viene indotta non appena vari recettori di riconoscimento dei patogeni rilevano le particelle virali in arrivo nelle cellule ospiti. Ciò porta alla programmazione della morte delle cellule infette e alla segnalazione alle cellule sane vicine attraverso tre percorsi interconnessi chiamati piroptosi, apoptosi e necroptosi, recentemente coniati come un unico processo, PANoptosis1.
La PANoptosi comporta l’elaborazione proteolitica di molte proteine dell’ospite e virali dall’induzione all’esecuzione. Tale elaborazione delle proteine è principalmente guidata da una famiglia di proteasi della cisteina chiamate caspasi 1,2. Sono note fino a 18 caspasi (dalla caspasi 1 alla caspasi 18)3. La maggior parte delle caspasi sono espresse come pro-caspasi e attivate subendo il proprio processo proteolitico mediante autocatalisi o altre caspasi4 in risposta a uno stimolo come un’infezione virale. Si pensava che la PANoptosi delle cellule infette da IAV fosse un meccanismo di difesa dell’ospite, ma IAV ha evoluto modi per eludere e sfruttarlo per facilitare la sua replicazione 1,2,5,6. Uno di questi è quello di antagonizzare i fattori dell’ospite attraverso la scissione o la degradazione mediata dalla caspasi che sono intrinsecamente antivirali o interferiscono con una delle fasi del ciclo di vita IAV. A tal fine, è stato scoperto che i fattori dell’ospite, cortactina, HDAC4 e HDAC6 subiscono una scissione o degradazione mediata da caspasi nelle cellule epiteliali infette da IAV 7,8,9. HDAC4 e HDAC6 sono fattori anti-IAV 8,10 e la cortactina interferisce con la replicazione IAV in una fase successiva dell’infezione, potenzialmente durante l’assemblaggio virale e il germogliamento 11.
Inoltre, vengono attivate anche varie caspasi che, a loro volta, scindono più proteine per attivare la risposta infiammatoria dell’ospite durante l’infezione IAV 1,2. Inoltre, la nucleoproteina (NP), la proteina M2 del canale ionico di IAV 12,13,14 e varie proteine di altri virus 3,15,16 subiscono anche una scissione mediata da caspasi durante l’infezione, che influenza la patogenesi virale. Pertanto, vi è una continua necessità di studiare la scissione mediata dalla caspasi o la degradazione delle proteine dell’ospite e virali durante le infezioni da IAV e altri virus per comprendere le basi molecolari della patogenesi virale. Qui, i metodi sono presentati per (1) valutare la scissione o la degradazione di tali proteine da parte delle caspasi, (2) identificare tali caspasi e (3) individuare i siti di scissione.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stabilito che i virus adattano i fattori e i percorsi dell’ospite a loro vantaggio. A loro volta, le cellule ospiti resistono a ciò impiegando varie strategie. Una di queste strategie è la PANoptosis, che le cellule ospiti usano come strategia antivirale contro le infezioni virali. Tuttavia, virus come IAV hanno evoluto le proprie strategie per contrastare la PANoptosi e sfruttarla a loro vantaggio 1,3,6. Questa interazione…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore riconosce Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nuova Zelanda), H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), Dipartimento di Microbiologia e Immunologia e Scuola di Scienze Biomediche (Università di Otago).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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