זיהום בנגיף שפעת A (IAV) מפעיל את הקספאזות שמבקעות חלבונים פונדקאיים ונוגפיים, אשר בתורם הם בעלי תפקידים פרו-ויראליים. על ידי שימוש במעכבים, הפרעות RNA, מוטגנזה מכוונת אתר, וטכניקות כתם מערביות ו- RT-qPCR, זוהו קספאזות בתאי יונקים נגועים המבקעים קורטקטין מארח והיסטון דאקטילאזות.
Caspases, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, מתזמרת מוות תאי מתוכנת בתגובה לגירויים שונים, כולל זיהומים מיקרוביאליים. מוות תאי מתוכנת, שתואר בתחילה כמתרחש על ידי אפופטוזיס, ידוע כיום כמקיף שלושה מסלולים הקשורים זה בזה: פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, יחד נטבעו כתהליך אחד, PANoptosis. השפעה זיהום בנגיף (IAV) משרה PANoptosis בתאי יונקים על ידי גרימת הפעלה של קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מארחים שונים כמו גם ויראליים, מה שמוביל לתהליכים כמו הפעלת התגובה האנטי-ויראלית המולדת של המארח או השפלה של חלבונים מארחים אנטגוניסטיים. בהקשר זה, ביקוע קספאז 3 בתיווך של קורטקטין מארח, היסטון דאצטילאז 4 (HDAC4) והיסטון דאצטילאז 6 (HDAC6) התגלה הן בתאי אפיתל של בעלי חיים והן בתאי אפיתל אנושיים בתגובה לזיהום ב- IAV. כדי להדגים זאת, נעשה שימוש במעכבים, הפרעות RNA ומוטגנזה מכוונת אתר, ולאחר מכן, הבקיעה או ההתנגדות לביקוע וההתאוששות של פוליפפטידים של קורטקטין, HDAC4 ו- HDAC6 נמדדו על ידי כתם מערבי. שיטות אלה, בשילוב עם RT-qPCR, יוצרות אסטרטגיה פשוטה אך יעילה לזיהוי הפונדקאי, כמו גם חלבונים נגיפיים העוברים ביקוע בתיווך קספאז במהלך זיהום של IAV או נגיפים אחרים בבני אדם ובבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את התוצאות המייצגות של אסטרטגיה זו, והדרכים להפוך אותה ליעילה יותר נדונות גם הן.
נגיף שפעת A (IAV) הוא חבר אב טיפוס במשפחת Orthomyxoviridae וידוע כגורם למגפות עולמיות ולמגפות בלתי צפויות. IAV גורם למחלה נשימתית אנושית, שפעת, הידועה בכינויה “שפעת”. שפעת היא מחלה חריפה הגורמת להשראת תגובות חיסוניות מולדות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות ולמוות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה האנושיות. שני התהליכים נשלטים על ידי תופעה הנקראת מוות תאי מתוכנת1. האיתות למוות תאי מתוכנת מושרה ברגע שקולטני זיהוי פתוגנים שונים חשים את חלקיקי הנגיף הנכנסים בתאים המארחים. זה מוביל לתכנות של מוות של תאים נגועים ואיתות לתאים בריאים שכנים על ידי שלושה מסלולים מחוברים הנקראים פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס – שנטבעו לאחרונה כתהליך אחד, PANoptosis1.
PANoptosis כרוך בעיבוד פרוטאוליטי של חלבונים רבים של פונדקאים ונגיפים משלב האינדוקציה ועד לביצוע. עיבוד כזה של חלבונים מובל בעיקר על ידי משפחה של פרוטאזות ציסטאין הנקראות קספאזות 1,2. עד 18 קספאזות (מקספאזה 1 עד קספאזה 18) ידועות3. רוב הקספאזות מבוטאות כפרו-קספאזות ומופעלות על ידי עיבוד פרוטאוליטי משלהן על ידי אוטוקטליזה או קספאזותאחרות 4 בתגובה לגירוי כמו זיהום בווירוס. ה-PANoptosis של תאים נגועים ב-IAV נחשב למנגנון הגנה מארח, אך IAV פיתח דרכים להתחמק ממנו ולנצל אותו כדי להקל על שכפולו 1,2,5,6. אחד מהם הוא לנטרל את הגורמים המארחים באמצעות ביקוע או השפלה בתיווך קספאז שהם אנטי-ויראליים מטבעם או מפריעים לאחד השלבים במחזור החיים של ה-IAV. לשם כך התגלו גורמים מארחים, קורטקטין, HDAC4 ו-HDAC6 שעברו ביקוע או השפלה בתיווך קספאז בתאי אפיתל נגועים ב-IAV 7,8,9. ה-HDAC4 וה-HDAC6 הם גורמים אנטי-IAV8,10, והקורטקטין מפריע לשכפול ה-IAV בשלב מאוחר יותר של ההדבקה, באופן פוטנציאלי במהלך הרכבת הנגיף וניצנים 11.
בנוסף, מופעלות גם קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מרובים כדי להפעיל את התגובה הדלקתית של המארח במהלך זיהום ב- IAV 1,2. יתר על כן, נוקליאופרוטאין (NP), חלבון M2 תעלת יונים של IAV 12,13,14, וחלבונים שונים של נגיפים אחרים 3,15,16 עוברים גם הם ביקוע בתיווך קספאז במהלך ההדבקה, המשפיע על פתוגנזה נגיפית. לכן, יש צורך מתמשך לחקור ביקוע בתיווך קספאז או השפלה של חלבונים מארחים ונגיפיים במהלך IAV וזיהומים נגיפיים אחרים כדי להבין את הבסיס המולקולרי של פתוגנזה נגיפית. כאן מוצגות השיטות כדי (1) להעריך את הבקיעה או הפירוק של חלבונים כאלה על ידי קספאזות, (2) לזהות את הקספאזות האלה, ו-(3) לאתר את אתרי הבקיעה.
נקבע כי וירוסים מתאימים את הגורמים והמסלולים המארחים לטובתם. בתורו, התאים המארחים מתנגדים לכך על ידי שימוש באסטרטגיות שונות. אחת מאותן אסטרטגיות היא PANoptosis, שבה משתמשים תאים מארחים כאסטרטגיה אנטי-ויראלית נגד זיהומים בנגיף. עם זאת, וירוסים כמו IAV פיתחו אסטרטגיות משלהם כדי להתמודד עם PANoptosis ו?…
The authors have nothing to disclose.
המחבר מכיר את ג’ניפר טיפר, בילאן לי, ג’סי ואן ווסטרינן, קווין הרוד, דה-יואן צ’ן, פרג’אנה אחמד, סוניה מרוס, קנת ימאדה, ריצ’רד וובי, משאבי BEI (NIAID), המועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד, קרן מוריס ופיליס פייקל (ניו זילנד), קרן H.S. ו- J.C. Anderson (דנידין), והמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה ובית הספר למדעים ביו-רפואיים (אוניברסיטת אוטגו).
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |