Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Le forme delle cellule e molti dei loro compartimenti interni dipendono dalle membrane lipidiche che le circondano. Le membrane sono strutture viscoelastiche che possono essere deformate attraverso interazioni con proteine, selezione lipidica e forze interne ed esterne che agiscono per generare una varietà di forme 1,2,3,4. Queste forme sono spesso descritte in termini di curvatura della membrana. Le cellule utilizzano una suite diversificata di proteine in grado di assemblarsi preferenzialmente su particolari curvature di membrana per garantire un controllo spazio-temporale definito su processi tra cui il traffico cellulare, la citochinesi e la migrazione ^5,6. La dinamica dei macchinari cellulari sulla membrana è notevolmente difficile da osservare a causa della difficoltà di bilanciare il tempo e la risoluzione spaziale con la salute delle cellule. Mentre le tecniche di super-risoluzione possono offrire una visione dettagliata di tali strutture, richiedono lunghe acquisizioni che non sono suscettibili ai tempi di assemblaggio / smontaggio per la maggior parte dei macchinari. Inoltre, la complessità molecolare di questi assemblaggi nel loro ambiente nativo e la moltitudine di ruoli che un singolo componente può svolgere rendono i sistemi di ricostituzione minimi uno strumento prezioso per studiare la capacità funzionale delle molecole.

Sono stati sviluppati mimetici di membrana minimi per studiare le proprietà della membrana e le interazioni proteina-membrana al di fuori della cellula. I mimetici di membrana variano da doppi strati lipidici indipendenti, come liposomi o vescicole unilamellari giganti, a doppi strati lipidici supportati (SLB)7,8,9,10. Le SLB sono membrane biomimetiche ancorate al supporto sottostante, tipicamente composte da vetro, mica o silice^11,12. È possibile utilizzare una varietà di geometrie, tra cui superfici planari, sfere, barre e persino substrati ondulati o micropatterati per sondare simultaneamente le interazioni proteina-membrana su curvature concave e convesse¹ 3,14,15,16,17,18 . La formazione di due strati inizia con l’adsorbimento delle vescicole su una superficie idrofila, seguita dalla fusione e dalla rottura per formare un doppio strato continuo (Figura 1)¹⁹. I doppi strati supportati sono particolarmente suscettibili alla microscopia ottica ed elettronica, fornendo sia una migliore risoluzione temporale che spaziale rispetto a quella spesso ottenibile nelle cellule. Le SLB curve forniscono in particolare un mezzo interessante per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in assenza di una significativa deformazione della membrana, consentendo di distinguere tra rilevamento della curvatura e induzione della curvatura, che sono spesso impossibili da separare nei sistemi indipendenti.

Le settine sono una classe di proteine citoscheletriche che formano filamenti ben note per la loro capacità di assemblarsi su membrane curve positive ^6,18,20. Nel corso del ciclo cellulare nel lievito, le settine si assemblano in un anello e devono riorganizzarsi per formare le strutture a clessidra e a doppio anello associate all’emergenza delle gemme e alla citochinesi, rispettivamente²¹. Mentre un bel lavoro è stato fatto usando la microscopia elettronica replica al platino per osservare l’architettura della settina in vari stadi del ciclo cellulare²², guardare l’assemblaggio della settina nel tempo usando la microscopia ottica nel lievito ha incontrato una risoluzione spaziale limitata. Precedenti lavori sulle settine utilizzando monostrati lipidici visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati in grado di ricostituire diverse strutture di settina interessanti come anelli, fasci e garze²³. Tuttavia, le tecniche EM sono anche limitate nella loro risoluzione temporale, a differenza della microscopia a fluorescenza. Al fine di risolvere meglio i parametri cinetici del processo multiscala di assemblaggio della settina, ci siamo rivolti alla mimetica di membrana supportata, dove è possibile controllare attentamente la geometria della membrana, le condizioni del campione e la modalità di imaging.

I protocolli qui descritti utilizzano SLB planari o curvi, proteine purificate e una combinazione di tecniche di microscopia. La microscopia confocale a fluorescenza quantitativa e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) sono state utilizzate sia per misurare il legame proteico di massa su varie curvature di membrana, sia per misurare la cinetica di legame di singole molecole. Inoltre, questo protocollo è stato adattato per essere utilizzato con la microscopia elettronica a scansione (SEM) per esaminare l’ultrastruttura proteica su diverse curvature della membrana. Mentre il focus di questi protocolli è sul citoscheletro della settina, i protocolli possono essere facilmente modificati per indagare la sensibilità alla curvatura di qualsiasi proteina che il lettore trova interessante. Inoltre, coloro che lavorano in campi come l’endocitosi o il traffico vescicolare possono trovare queste tecniche utili per sondare gli assemblaggi dipendenti dalla curvatura di complessi multi-proteici.