在膜上重构隔膜组件以研究生物物理性质和功能

细胞的形状及其许多内部隔室取决于它们周围的脂质膜。膜是粘弹性结构，可以通过与蛋白质的相互作用，脂质分选以及作用的内部和外部力来产生各种形状^{而变形1，2，3，4}。这些形状通常用膜曲率来描述。细胞使用一套多样化的蛋白质，能够优先组装或“感知”特定的膜曲率，以确保对包括细胞运输，细胞分裂和迁移在内的过程进行定义的时空控制^5，6。由于难以平衡时间和空间分辨率与细胞健康，因此很难观察到膜上细胞机制的动力学。虽然超分辨率技术可以提供这些结构的详细视图，但它们需要长时间的采集，而这些采集不适合大多数机械的装配/拆卸时间尺度。此外，这些组件在其天然环境中的分子复杂性以及单个组分可以发挥的众多作用使得最小重构系统成为研究分子功能能力的宝贵工具。

已经开发了最小膜模拟物来研究细胞外的膜特性和蛋白质 – 膜相互作用。膜模拟物从独立的脂质双分子层（例如脂质体或巨型单层囊泡）到支撑脂质双分子层（SLBs）^{7，8，9，10}不等。SLB是锚定在下层支撑物上的仿生膜，通常由玻璃，云母或二氧化硅^11，12组成。可以使用各种几何形状，包括平面，球体，棒，甚至起伏或微图案底物，以同时探测凹曲率和凸曲率上的蛋白质 – 膜相互作用1 ^3，14，^{15，16，17，18}.双层形成始于囊泡吸附到亲水表面上，然后熔合和破裂以形成连续的双层（图1）¹⁹。支撑的双层特别适合光学和电子显微镜检查，提供比细胞中通常可以实现的更好的时间和空间分辨率。弯曲的SLB特别提供了一种有吸引力的方法，可以在没有显着的膜变形的情况下探测蛋白质曲率灵敏度，使人们能够区分曲率传感和曲率感应，这在独立系统中通常是不可能分离的。

Septins是一类形成细丝的细胞骨架蛋白，以其在正弯曲膜上组装的能力而闻名^6，18，20。在酵母细胞周期的过程中，隔膜蛋白组装成一个环，并且必须重新排列以形成与芽出现和细胞分裂相关的沙漏和双环结构，分别为²¹。虽然已经使用铂复制电子显微镜在不同的细胞周期阶段²²观察隔膜蛋白结构，但使用酵母中的光学显微镜观察隔膜蛋白随时间的组装已经遇到了有限的空间分辨率。以前使用透射电子显微镜（TEM）可视化的脂质单层的隔膜蛋白的工作能够重建几个有趣的隔膜结构，如环，束和纱布²³。然而，与荧光显微镜不同，EM技术在时间分辨率方面同样受到限制。为了更好地解决隔膜组装的多尺度过程的动力学参数，我们转向了支持的膜模拟物，在那里人们可以仔细控制膜的几何形状，样品条件和成像模态。

这里描述的方案使用平面或弯曲的SLB，纯化的蛋白质和显微镜技术的组合。定量荧光共聚焦显微镜和全内反射荧光显微镜（TIRFM）用于测量本体蛋白质与各种膜曲率的结合，以及测量单分子的结合动力学。此外，该方案已被调整为与扫描电子显微镜（SEM）一起使用，以检查不同膜曲率上的蛋白质超微结构。虽然这些方案的重点是隔膜细胞骨架，但可以很容易地修改实验方案，以研究读者感兴趣的任何蛋白质的曲率敏感性。此外，那些在内吞作用或水泡运输等领域工作的人可能会发现这些技术可用于探测多蛋白复合物的曲率依赖性组装体。