Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por Nippostrongylus brasiliensis
概要
Las células T e ILC2 que expresan IL-9 se inducen durante la infección por N. brasiliensis , sin embargo, su caracterización se ha pasado por alto en gran medida en el intestino infectado debido a su baja frecuencia y cinética diferencial. Este protocolo describe el aislamiento de estas células de diferentes órganos diana y la confirmación de su identidad mediante citometría de flujo en diferentes etapas de infección.
Abstract
IL-9 es una citocina pleiotrópica asociada con diversos procesos, incluida la inmunidad antitumoral, la inducción de patologías alérgicas y la respuesta inmune contra las infecciones por helmintos, donde desempeña un papel importante en la expulsión del parásito. En un modelo murino de infección por Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 es producida principalmente por linfocitos T CD4 + y células linfoides innatas que se encuentran en el pulmón, el intestino delgado y los ganglios linfáticos drenantes. Dadas las dificultades técnicas involucradas en la tinción intracelular de IL-9, así como la complejidad de aislar células hematopoyéticas del intestino delgado tras la infección, existe una necesidad apremiante de un protocolo completo pero directo para analizar la expresión de IL-9 en diferentes tejidos linfoides y no linfoides en este modelo. El protocolo descrito aquí describe la cinética de IL-9 producida por las células T CD4 + y las células linfoides innatas en el pulmón y el intestino delgado, los principales órganos dirigidos por N. brasiliensis, así como en los ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, a lo largo de la infección. Además, detalla el número de larvas necesarias para la infección, dependiendo del tipo de célula y órgano de interés. Este protocolo tiene como objetivo ayudar en la estandarización de ensayos para ahorrar tiempo y recursos al ofrecer la oportunidad de centrarse en las células, órganos y etapas específicas de la enfermedad de interés en el modelo de infección por N. brasiliensis.
Introduction
Los anquilostomas son parásitos intestinales que infectan a aproximadamente 700 millones de personas en todo el mundo, principalmente en áreas tropicales de países subdesarrollados. Las infecciones de alta intensidad con Ancylostoma duodenale y Necator americanus, los parásitos anquilostomas más comunes en humanos, causan anemia y deficiencia de proteínas que pueden resultar en retraso en el crecimiento y el desarrollo mental1. N. americanus y el parásito roedor Nippostrongylus brasiliensis inducen una respuesta inmune prototípica tipo 2 en su huésped y comparten similitudes en su ciclo de vida. Por lo tanto, la infección de ratones con N. brasiliensis es el modelo más comúnmente utilizado para las infecciones por anquilostomas humanas. Estadio 3 (L3) Las larvas infecciosas de N. brasiliensis se mueven de la piel al pulmón en las primeras horas después de la infección. Una vez en el pulmón, se convierten en L4 y migran por la tráquea para ser tragados, pasan a través del estómago y llegan al intestino para convertirse en adultos (L5) dentro de 4-5 días. En el intestino, los gusanos L5 ponen huevos que se excretan en las heces para reiniciar el ciclo de vida del parásito2.
La respuesta inmune inducida por N. brasiliensis se caracteriza por un aumento en varias citoquinas tipo 2, incluyendo IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, junto con eosinofilia, basofilia, cáliz e hiperplasia de mastocitos, y una mayor producción de IgG1 e IgE. La mayoría de los estudios que intentan identificar y definir las respuestas inmunes provocadas por la infección por N. brasiliensis se centran en el papel de IL-4 o IL-13 en este modelo3. Sin embargo, la identificación y caracterización de las células que expresan IL-9 y la función de esta citoquina se habían pasado por alto en gran medida, hasta que Licona-Limón et al. publicaron el primer estudio que demuestra un papel crítico para IL-9 en la respuesta inmune contra N. brasiliensis. Utilizando ratones reporteros, este estudio describió las células T (principalmente T helper 9) y las células linfoides innatas tipo 2 (ILC2) como los principales subconjuntos celulares que expresan IL-9 tras la infección4.
El aislamiento y la caracterización de las células inmunes de los pulmones infectados por helmintos es factible, y ha sido ampliamente reportado 3,4. Sin embargo, debido a la remodelación tisular inherente y la producción de moco, hacerlo en el intestino infectado resultó ser un desafío técnico, hasta la reciente publicación de Ferrer-Font et al.5. El grupo describió un protocolo para aislar y analizar suspensiones unicelulares de subconjuntos inmunes de intestinos murinos infectados con Heligmosomoides polygyrus. Basándonos en él, ahora hemos estandarizado un protocolo para el aislamiento y el análisis citométrico de las células linfoides que expresan IL-9 del intestino infectado por N. brasiliensis. Además, hemos establecido la cinética de IL-9 a partir de diferentes fuentes celulares y ubicaciones anatómicas a lo largo de la infección.
La caracterización de las distintas poblaciones celulares involucradas en esta infección es vital para una comprensión más amplia de la respuesta inmune al parásito y su interacción con el huésped. Este protocolo integral proporciona una ruta clara para aislar y analizar las células productoras de IL-9 de los órganos deseados en las etapas de interés de la enfermedad, lo que permite una mejora aguda del conocimiento sobre el papel de estas células en la infección por N. brasiliensis y las infecciones parasitarias en general.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una comprensión completa de las interacciones parásito-huésped intestinal y las respuestas inmunes a la infección por helmintos requiere la identificación y el análisis de las diferentes poblaciones celulares y moléculas efectoras que son clave para la inducción de la remodelación tisular y la expulsión de gusanos. Las helmintiasis transmitidas por el suelo representan un gran problema en los países en desarrollo de todo el mundo. Sin embargo, hasta hace poco, no se disponía de un protocolo que permitiera el …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a José Luis Ramos-Balderas por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la siguiente subvención a PLL del CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P y EO-M recibieron una beca del CONACYT (736162 y 481437, respectivamente). MCM-M recibió una beca del CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
参考文献
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