Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel
概要
IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.
Abstract
IL-9 is een pleiotroop cytokine geassocieerd met verschillende processen, waaronder antitumorimmuniteit, inductie van allergische pathologieën en de immuunrespons tegen worminfecties, waar het een belangrijke rol speelt bij de uitdrijving van de parasiet. In een muizenmodel van Nippostrongylus brasiliensis-infectie wordt IL-9 voornamelijk geproduceerd door CD4 + T-lymfocyten en aangeboren lymfoïde cellen in de longen, dunne darm en drainerende lymfeklieren. Gezien de technische problemen die gepaard gaan met de intracellulaire kleuring van IL-9, evenals de complexiteit van het isoleren van hematopoëtische cellen uit de dunne darm bij infectie, is er een dringende behoefte aan een uitgebreid maar eenvoudig protocol om de expressie van IL-9 in verschillende lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels in dit model te analyseren. Het hier beschreven protocol schetst de kinetiek van IL-9 geproduceerd door CD4 + T-cellen en aangeboren lymfoïde cellen in de longen en dunne darm, de belangrijkste organen die het doelwit zijn van N. brasiliensis, evenals in de mediastinale en mesenteriale lymfeklieren, gedurende de infectie. Bovendien beschrijft het het aantal larven dat nodig is voor infectie, afhankelijk van het celtype en het orgaan van belang. Dit protocol is bedoeld om te helpen bij de standaardisatie van testen om tijd en middelen te besparen door de mogelijkheid te bieden om zich te concentreren op de specifieke cellen, organen en ziektestadia van belang in het N. brasiliensis-infectiemodel.
Introduction
Haakwormen zijn darmparasieten die wereldwijd ongeveer 700 miljoen mensen infecteren, meestal in tropische gebieden in onderontwikkelde landen. Infecties met hoge intensiteit met Ancylostoma duodenale jp Necator americanus, de meest voorkomende haakwormparasieten bij de mens, veroorzaken bloedarmoede en eiwittekort dat kan leiden tot vertraagde groei en mentale ontwikkeling1. N. americanus en de knaagdierparasiet Nippostrongylus brasiliensis induceren een prototypische type 2 immuunrespons in hun gastheer en delen overeenkomsten in hun levenscyclus. Vandaar dat de infectie van muizen met N. brasiliensis het meest gebruikte model is voor menselijke haakworminfecties. Stadium 3 (L3) N. brasiliensis infectieuze larven verplaatsen zich van de huid naar de longen in de eerste paar uur na infectie. Eenmaal in de long worden ze L4 en migreren ze de luchtpijp op om te worden ingeslikt, door de maag te gaan en de darm te bereiken om binnen 4-5 dagen volwassenen (L5) te worden. In de darm leggen L5-wormen eieren die worden uitgescheiden in de ontlasting om de levenscyclus van de parasiet opnieuw op te starten2.
De immuunrespons geïnduceerd door N. brasiliensis wordt gekenmerkt door een toename van verschillende type 2 cytokines, waaronder IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 en IL-13, samen met eosinofilie, basofilie, bokaal- en mestcelhyperplasie en verhoogde IgG1- en IgE-productie. De meeste studies die proberen de immuunresponsen te identificeren en te definiëren die worden opgewekt bij N. brasiliensis-infectie zijn gericht op de rol van IL-4 of IL-13 in dit model3. De identificatie en karakterisering van IL-9-tot expressie brengende cellen en de functie van dit cytokine waren echter grotendeels over het hoofd gezien, totdat Licona-Limón et al. de eerste studie publiceerden die een cruciale rol voor IL-9 in de immuunrespons tegen N. brasiliensis aantoonde. Met behulp van reportermuizen beschreef deze studie T-cellen (meestal T-helper 9) en type 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2’s) als de belangrijkste cellulaire subsets die IL-9 tot expressie brengen bij infectie4.
Isolatie en karakterisering van immuuncellen uit met worm geïnfecteerde longen is haalbaar en is uitgebreid gerapporteerd 3,4. Vanwege de inherente weefselremodellering en slijmproductie bleek het echter een technische uitdaging om dit in de geïnfecteerde darm te doen, tot de recente publicatie van Ferrer-Font et al.5. De groep schetste een protocol voor het isoleren en analyseren van eencellige suspensies van immuunsubsets van Heligmosomoides polygyrus-geïnfecteerde muizendarmen. Op basis hiervan hebben we nu een protocol gestandaardiseerd voor isolatie en cytometrische analyse van IL-9-tot expressie brengende lymfoïde cellen uit de met N. brasiliensis geïnfecteerde darm. Daarnaast hebben we IL-9-kinetiek vastgesteld uit verschillende cellulaire bronnen en anatomische locaties gedurende de infectie.
Het karakteriseren van de verschillende celpopulaties die betrokken zijn bij deze infectie is van vitaal belang voor een breder begrip van de immuunrespons op de parasiet en de interactie met de gastheer. Dit uitgebreide protocol biedt een duidelijke route om IL-9-producerende cellen te isoleren en te analyseren van gewenste organen in ziektestadia van belang, waardoor de kennis over de rol van deze cellen bij N. brasiliensis-infectie en parasietinfecties in het algemeen sterk kan worden verbeterd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een volledig begrip van intestinale parasiet-gastheer interacties en immuunresponsen op helminth-infectie vereist de identificatie en analyse van de verschillende celpopulaties en effectormoleculen die essentieel zijn voor de inductie van weefselremodellering en wormuitdrijving. Bodemoverdraagbare worminfecties vormen een groot probleem in ontwikkelingslanden over de hele wereld. Tot voor kort was er echter geenprotocol beschikbaar dat de analyse mogelijk maakte van zeldzame celpopulaties in de du…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen José Luis Ramos-Balderas bedanken voor zijn technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie aan PLL van CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P en EO-M ontvingen een fellowship van CONACYT (respectievelijk 736162 en 481437). MCM-M ontving een fellowship van CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
参考文献
- Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites – Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
- Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
- Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
- Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
- Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
- Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
- Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
- Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
- Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
- old Spring Harbor Protocols. Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
- Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
- Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
- Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
- Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
- Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).
