Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling
概要
Dit protocol schetst in detail de voorbereiding van nucleosomale complexen met behulp van twee methoden voor monstervoorbereiding voor het bevriezen van TEM-roosters.
Abstract
DNA-reparatie in de context van chromatine is slecht begrepen. Biochemische studies met nucleosoomkerndeeltjes, de fundamentele herhalende eenheid van chromatine, tonen aan dat de meeste DNA-reparatie-enzymen DNA-schade verwijderen met verminderde snelheden in vergelijking met vrij DNA. De moleculaire details over hoe base excision repair (BER) enzymen DNA-schade in nucleosomen herkennen en verwijderen, zijn niet opgehelderd. Biochemische BER-gegevens van nucleosomale substraten suggereren echter dat het nucleosoom verschillende structurele barrières vertoont, afhankelijk van de locatie van de DNA-laesie en het enzym. Dit geeft aan dat de mechanismen die door deze enzymen worden gebruikt om DNA-schade in vrij DNA te verwijderen, anders kunnen zijn dan die welke in nucleosomen worden gebruikt. Aangezien het grootste deel van het genomische DNA is geassembleerd tot nucleosomen, is structurele informatie van deze complexen nodig. Tot op heden ontbreekt het de wetenschappelijke gemeenschap aan gedetailleerde protocollen om technisch haalbare structurele studies van deze complexen uit te voeren. Hier bieden we twee methoden om een complex van twee genetisch gefuseerde BER-enzymen (Polymerase β en AP Endonuclease1) te bereiden die gebonden zijn aan een single-nucleotide-gap nabij de entry-exit van het nucleosoom voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structurele bepaling. Beide methoden voor monstervoorbereiding zijn compatibel voor het vitrificeren van kwaliteitsroosters via ondervriezen. Dit protocol kan worden gebruikt als uitgangspunt om andere nucleosomale complexen te bereiden met verschillende BER-factoren, pioniertranscriptiefactoren en chromatine-modificerende enzymen.
Introduction
Eukaryote DNA wordt georganiseerd en verdicht door histoneiwitten, die chromatine vormen. Het nucleosoomkerndeeltje (NCP) vormt de fundamentele herhalende eenheid van chromatine die de toegankelijkheid tot DNA-bindende eiwitten reguleert voor DNA-reparatie, transcriptie en replicatie1. Hoewel de eerste röntgenkristalstructuur van het NCP meer dan twee decennia geleden voor het eerst werd opgelost2 en er sinds 3,4,5,6 nog veel meer structuren van het NCP zijn gepubliceerd, zijn DNA-reparatiemechanismen in nucleosomale substraten nog niet afgebakend. Het blootleggen van de moleculaire details die ten grondslag liggen aan DNA-reparatie in chromatine vereist structurele karakterisering van de deelnemende componenten om te begrijpen hoe lokale structurele kenmerken van het NCP DNA-reparatieactiviteiten reguleren. Dit is met name belangrijk in de context van base-excisieherstel (BER), aangezien biochemische studies met BER-enzymen unieke DNA-reparatiemechanismen in nucleosomen suggereren die afhankelijk zijn van enzymspecifieke structurele vereisten voor katalyse en de structurele positie van de DNA-laesie binnen het nucleosoom 7,8,9,10,11,12,13 . Aangezien BER een essentieel DNA-reparatieproces is, is er veel belangstelling om deze lacunes op te vullen en tegelijkertijd een startpunt vast te stellen van waaruit andere technisch haalbare structurele studies met relevante nucleosomale complexen kunnen worden uitgevoerd.
Cryo-EM wordt snel de voorkeursmethode voor het oplossen van de driedimensionale (3D) structuur van complexen waarvan de grootschalige voorbereiding van homogene monsters een uitdaging is. Hoewel het ontwerp en de zuivering van NCP’s gecomplexeerd met een DNA-reparatiefactor (NCP-DRF) waarschijnlijk op maat gemaakte optimalisatie vereist, biedt de hier gepresenteerde procedure om een stabiel NCP-DRF-complex te genereren en te bevriezen details over hoe het monster en de cryo-EM-netwerkvoorbereiding kunnen worden geoptimaliseerd. Twee workflows (die elkaar niet uitsluiten) in figuur 1 en de specifieke details in het protocol identificeren kritieke stappen en bieden strategieën voor het optimaliseren van deze stappen. Dit werk zal het chromatine- en DNA-reparatieveld voortstuwen in een richting waarin het aanvullen van biochemische met structurele studies technisch haalbaar wordt om de moleculaire mechanismen van nucleosomaal DNA-herstel beter te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een specifiek protocol voor het zuiveren van de DNA-reparatiefactor zal afhankelijk zijn van het enzym van belang. Er zijn echter enkele algemene aanbevelingen, waaronder het gebruik van recombinante methoden voor eiwitexpressie en -zuivering18; als het eiwit van belang te klein is (<50 kDa), was structuurbepaling door cryo-EM tot voor kort bijna onmogelijk door het gebruik van fusiesystemen19, nanobody-bindende steigers20 en het optimaliseren van be…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Dr. Mario Borgnia van de cryo-EM-kern van het National Institute of Environmental Health Sciences en Dr. Joshua Strauss van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill voor hun mentorschap en training in de cryo-EM-netwerkvoorbereiding. We danken ook Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende voor de technische assistentie in de beginfase van dit project. We waarderen de belangrijke bijdrage en steun van wijlen Dr. Samuel H. Wilson en zijn laboratoriumleden, in het bijzonder Dr. Rajendra Prasad en Dr. Joonas Jamsen voor de zuivering van het genetisch gefuseerde APE1-Polβ-complex. Onderzoek is ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [subsidienummers Z01ES050158, Z01ES050159 en K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
参考文献
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. 生化学. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
