がん細胞の層間剥離および浸潤能を定量化することによって転移特性をスコアリングするCAM-Delamアッセイ

簡単に言えば、 図1は 、CAM-Delamアッセイにおける全体的なステップを要約する。以下のプロトコルは、30個の培養受精鶏卵と、3つのリング/卵に別々に播種され、4つの時点で分析された2つの異なる癌細胞株の使用に基づいています。 1. 卵の孵化 地元の孵化場の受精したひよこの卵を使用し、90%以上の受精を保証する注:卵は室温(RT)で4日以上保存してはなりません。スウェーデンでは、胚性ニワトリの実験的使用のための倫理的許可は、胚発生日(E)14以降からのみ必要とされる。 必要に応じて、乾いたペーパータオルまたは水に濡れたペーパータオルを使用して、卵の汚れや羽毛を慎重に機械的に拭き取ります。 使用前に卵インキュベーターを70%エタノールで清掃して滅菌してください(毎回)。 卵トレイに所望の数の卵を置き、湿度70%で37.5〜38°Cの卵インキュベーターで鶏の卵を水平に孵化させる。これをインキュベーション0日目と考えてください(図1A)。 2. 計量ボート、プラスチック箱、解剖器具の準備 70%エタノールを使用して、30個の計量ボートと30個の小さなプラスチック製の箱(〜0.4L)を透明なキャップで滅菌します。 計量ボートと箱を層状フードで一晩(ON)乾燥させ、インキュベーション3日目にさらに使用するまで閉じたプラスチック製の箱に保管してください。 30個の孵卵あたり2Lの蒸留または脱イオン化H2Oを滅菌する。 2対のはさみと3対の鉗子を70%エタノールを噴霧して滅菌する。器具を空気乾燥させ、滅菌した箱に入れてインキュベーション3日目まで保管します。注:これらのアクション(ステップ2.1-2.4)は、インキュベーション3日目の前日であればいつでも実行できます。汚染を避けるために手袋を使用してください。 3.卵を開き、内部加湿チャンバーに移す 注:汚染を避けるために手袋とフェイスマスクを使用してください。 滅菌されたプラスチック製の箱に約50mLの滅菌H2Oを加える。汚染を避けるために、蓋を閉じた水で満たされた箱をRTで使用時まで保管してください。 孵化3日目に、はさみの鋭い部分を使って卵殻を割り、殻のまっすぐな開口部を切ります。 計量ボートの上で卵殻を手動で開き、卵白、卵黄、およびそれに付着した健康な胚を計量ボートで収集します(図1B)。実験のために、鼓動する心臓、無傷の卵黄、発達した血管(孵化した卵の>95%)を持つ無傷の胚を探してください。奇形の胚、鼓動する心臓のない胚、壊れた卵黄、または損傷した卵黄血管を含む卵子を捨てる。 計量ボートを内部の加湿チャンバーに静かに移します。メモ: 手順 3.2.-3.4 では、汚染を避けるためにできるだけ速く作業し、可能であれば層状フードを使用します。 内部加湿チャンバーを卵培養器内で孵化させる(図1C)。 殻のない卵を3日目から10日目まで、使用前に卵培養器で培養し(ステップ3.6を参照)、必要に応じて、インキュベーターに水を加えて湿度70%を維持します。 透明なプラスチック製の蓋を通して内部の加湿チャンバーに毎日死んだ胚や汚染された殻のない卵がないかチェックし、インキュベーターから取り出します。 4. シリコーンリングの調製 シリコーンリングを作製するには、好ましくは紙カッターを使用して、内径4mmおよび外径5mmのシリコーンチューブをそれぞれ〜1mmの厚さに切断する(図1D)。 シリコンリングを小さなガラス瓶(図1D)に移し、金属箔で覆い、オートクレーブなどを使用して滅菌します。注:汚染されている可能性のある未使用のシリコーンリングのオートクレーブを繰り返し行うと、シリコーンリングが膜に付着する能力が低下し、その後がん細胞/コラーゲン/RPMI溶液がリングの外側に漏れるため、避けてください。 滅菌シリコーンリングをRTに保管してください。注:このステップは、インキュベーション10日目の前日であればいつでも行うことができます。 5. がん細胞の作製 注:細胞培養培地、トリプシン、および1x PBSなどの溶液は4°Cで保存され、細胞に添加する前に水浴中で37°Cに加熱する必要があります。加熱後、ボトルを70%エタノールですすぎ、使用前に乾燥させてください。 目的の癌細胞株を、5%(v/v)CO2の存在下で37°Cの細胞培養インキュベーター内の関連する培養培地で培養する。注:ここで、U251-GFP膠芽腫およびPC-3U-GFP前立腺癌細胞は、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)および1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)を添加した完全RPMI培地-RPMI培地で培養した。 CAM-Delam アッセイの培養 10 日目に約 50 ×106 個のがん細胞を採取する準備ができるように、がん細胞の培養を計画します。 細胞培養培地を2〜3日ごとに交換するか、培地の色がピンクからオレンジ/黄色に変化したとき。 任意選択:癌細胞をCoCl2 で処理して低酸素を誘導し、細胞採取の1日前に層間剥離に対する分子機構的効果を調査する。注意: CoCl2 は中程度の毒性があります。ヒュームフードで慎重に取り扱い、製造元の指示に従ってください。 光から保護するために、アルミニウム箔で包まれた15mL 円錐管内の滅菌蒸留H2 0の10mLに0.0258gを溶解することによって、新鮮な20mM CoCl2ストック溶液を調製する。 50 mL の円錐管内で、直径 15 cm の細胞培養皿あたり 1% (v/v) PS (ただし FBS なし) を添加した 25 mL の RPMI 培地に 250 μL の 20 mM CoCl2 ストック溶液 を混ぜます。渦が優しく。 細胞培養皿から完全なRPMI培地を除去する。 滅菌した1x PBS 2xで細胞を洗浄する。 200 μM CoCl 2細胞トリプシン処理で25 mLのRPMI 培地を加える(ステップ5.6を参照)。 卵子孵化10日目に、250 μLのI型コラーゲン(5 mg/mL)と750 μLの細胞培養RPMI培地に10Sと1%(v/v)PSを添加した1 mLのコラーゲン/RPMIミックス(比1:3)を調製します。 癌細胞をトリプシン処理し、最初に細胞培養培地を除去し、1x PBSで2倍に洗浄することによって細胞を単離する。 直径15cmの細胞培養皿あたり3 mLのトリプシン溶液(0.05%)を加え、細胞が剥離するまで細胞培養インキュベーター内で2〜3分間インキュベートする。卓上の倒立顕微鏡を使用して、剥離した細胞を確認します。必要に応じて、フラスコの側面を軽く叩いて、残りのクラスター化または付着した細胞を取り除きます。 各細胞培養ディッシュに5 mLの完全RPMI培地を加えてトリプシンを不活化し、すべての細胞培養ディッシュから細胞懸濁液を50 mLチューブに集めた。 トリパンブルー排除法により癌細胞を計数し、細胞カウンターを用いて生細胞と死細胞を区別した。10 μLの細胞懸濁液を10 μLの0.4%トリパンブルー染色剤に加える。数回上下にピペッティングしてサンプルを混合し、チャンバーあたり10 μLの細胞混合物をセルカウンターのサンプルスライドにロードします。細胞数を3倍に繰り返して、細胞数/mLを確認します。 50 x106 個の生癌細胞を含む正しい体積の細胞培養懸濁液を500 × g で50 mLチューブに入れ、5分間遠心分離する。 上清を捨て、細胞ペレットをコラーゲン/RPMIミックス1mLと混合する。コラーゲンはゼラチン状の材料であるため、気泡の形成で細胞が失われないように、細胞を1mLピペットで非常にゆっくりと慎重に混合します。 調製した細胞懸濁液を氷の上に保管し、卵の作業領域に持ち込む。注:準備したがん細胞を氷の上に長時間置きすぎないようにしてください。調製した癌細胞は、15〜25分以内にCAM上に配置しなければならない。 6. CAMに癌細胞を播種する 注:汚染を避けるために手袋とフェイスマスクを使用してください。 孵化10日目に、孵化した殻のない卵と共に内部加湿チャンバーをインキュベーターから取り出した。注:孵化した卵の初期数の約90%を使用することができます。 図 2 を参照してください。 内部の加湿チャンバーを開き、滅菌された鉗子を使用してCAMに最大6つのシリコーンリングを置きます。注:シリコンリングを互いに近づけたり、大きな血管に近づけたりしないでください。 ピペッティングにより癌細胞懸濁液を混合して癌細胞の均一な分布を得、調製した癌細胞懸濁液の20μL(1×106 細胞)をシリコーンリングの内側に加える(図1E)。細胞を追加するときは、ピペットチップをCAMの上に保ち、膜を傷つけないようにしてください。注:以前の知見7によると、異なる癌細胞を同じCAM上の別々のリングに播種することができる。 内部の加湿チャンバーを閉じ、卵インキュベーターに入れます。 7. 関連する癌細胞とのCAMの単離 14時間、1.5日、2.5日、および3.5日のインキュベーション後、約7つの内部加湿チャンバーを取り出し、蓋を一度に1つずつ開きます。 一対のはさみで、CAM(いわゆるCAM-Delamサンプル)に結合した培養癌細胞をシリコーンリングの外側に切断することによって解剖する(図1F)。 分離したCAM-Delamサンプルを鉗子を用いて直ちに0.1 Mリン酸緩衝液(PB)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)に移し、組織の固定を行う。氷の上または4°Cで1時間保ちます。注: 4% PFA 溶液を 4 °C で最大 5 日間保存します。注意: PFA は有毒です。PFA粉末およびPFA溶液を取り扱うときは、ヒュームフードを使用し、フェイスマスクと手袋を着用してください。粉末や溶液の蒸気を吸い込まないでください。製造元の指示に従ってください。 ニワトリの胚を斬首し、特定のビンに生物学的廃棄物として廃棄する。 4% PFA溶液を除去し、0.1 M PB中の30%スクロースをCAM-Delamサンプルに加え、4°Cで1時間平衡化する。 解剖顕微鏡下で、鉗子を使用してシリコーンリングを慎重に取り外す。一対のはさみで、CAM-Delamサンプルを長方形に切り、中央に癌細胞を持たせます(図1G)。 一対の鉗子を用いて、CAM-Delamサンプルをペトリ皿内の凍結切片培地に移して余分なスクロースを除去し、次いで凍結切片培地にカビを埋め込む。 解剖顕微鏡下で、任意の針状の器具を使用して、埋め込み型に垂直方向にU字型のCAM-Delamサンプルを配置します(図1G)。 CAM-Delam サンプルを凍結し、-80 °C で保存します。 8. カムデラムサンプルのセクショニング 凍結したCAM-Delamサンプルを凍結切除法を用いて5~6枚の連続スライド上に10μmで切断する。 切片付きのスライドを-80°Cで保存するか、免疫組織化学染色に直接使用してください。 9. 免疫組織化学染色 イムノプロトコールを開始する前に、スライドを-80°CからRTまで5分間持ち込みます。 セクションが終わるスライドに疎水性マーカーで線を作ります。数分間乾かします。 スライドを加湿(H2O)チャンバーに入れ、約200〜500μLのブロッキング溶液(10%ウシ胎児血清および0.1%アジ化ナトリウムをトリス緩衝生理食塩水および0.1%Triton X-100 [TBST])で覆い、15〜30分間インキュベートする。メモ: このステップ以降は、スライドを乾燥させないでください。 ブロッキング溶液を注ぎ、ブロッキング溶液で希釈した目的の一次抗体100〜150μLと交換し、4°Cでオンにインキュベートする。 好ましくは、GFPまたは他の蛍光タグ付き癌細胞株を使用しない場合は、癌細胞マーカーと共に基底薄層を定義するためにウサギ抗ラミニン−111抗体を使用する。注:ここでは、ウサギのアンチフォンビルブランド因子もCAM内の血管を検出するために使用されました。 TBSTバッファーを充填したガラスキュベットを3枚用意する。 一次抗体溶液を注ぎ、スライドをガラスキュベットに移し、TBSTでそれぞれ5分間少なくとも3倍に洗浄する。 スライドから余分なTBSTを取り除き、柔らかい紙ティッシュで疎水性バリア領域から除去します。 スライドをブロッキング溶液で希釈した適切な二次蛍光抗体100〜150μLで覆い、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI)と組み合わせ、暗所でRTで1時間インキュベートする。 二次抗体溶液を注ぎ、スライドをガラスキュベットに移し、TBSTでそれぞれ5分間少なくとも3倍に洗浄する。 スライドから余分なTBSTを取り除き、柔らかい紙ティッシュで疎水性バリア領域から除去します。 スライドに蛍光付着剤を1~2滴入れてスライドを取り付け、気泡を避けてガラスカバースリップをそっと置きます。 分析する前にスライドを 4 °C で少なくとも 1 時間乾燥させ、スライドを 4 °C に保管します。 10. 顕微鏡イメージングと層間剥離スコアリング 切片をデジタルカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡を用いて、好ましくは10倍の倍率で撮影する(図1H)。 次の CAM-Delam スコアリング カテゴリを使用してセクションを分析します (図 3)。 目に見える変化のない無傷の基底薄層を探してください。 変化しているが損傷を受けていない基底ラミナを探します。 細胞の侵入なしに損傷した基底薄層を探してください。 細胞の侵入で損傷した基底薄層を探します。