Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden
概要
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Bildung von Mikrotubuli-Baugruppen in Form von Tactoiden unter Verwendung von MAP65, einem pflanzlichen Mikrotubuli-Vernetzer, und PEG als Crowding-Agent vor.
Abstract
Das Zytoskelett ist für die wichtige interne Organisation und Reorganisation innerhalb der Zelle verantwortlich, alles ohne einen Manager, der die Veränderungen leitet. Dies ist insbesondere bei der Mitose oder Meiose der Fall, bei der die Mikrotubuli während der Zellteilung die Spindel bilden. Die Spindel ist die Maschinerie, die verwendet wird, um genetisches Material während der Zellteilung zu trennen. Um selbstorganisierte Spindeln in vitro zu erzeugen, haben wir kürzlich eine Technik entwickelt, um Mikrotubuli で spindelartige Anordnungen mit einem minimalen Satz von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen und Crowding-Agenten zu rekonstituieren. Insbesondere wurde MAP65 verwendet, ein antiparalleler Mikrotubuli-Vernetzer aus Pflanzen, ein Homolog von Ase1 aus Hefe und PRC1 aus Säugetierorganismen. Dieser Vernetzer organisiert Mikrotubuli selbstorganisierend zu langen, dünnen, spindelartigen Mikrotubuli-selbstorganisierten Baugruppen. Diese Baugruppen ähneln auch Flüssigkristall-Tactoiden, und Mikrotubuli könnten als mesoskalige Mesogene verwendet werden. Hier werden Protokolle zur Herstellung dieser Mikrotubuli-Tactoide sowie zur Charakterisierung der Form der Baugruppen mittels Fluoreszenzmikroskopie und der Beweglichkeit der Bestandteile mittels Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen vorgestellt.
Introduction
Die Zellteilung durch Mitose ist einer der wichtigsten biologischen Prozesse, um das Leben zu erhalten. Die Mikrotubuli-Filamente, die aus Tubulin-Dimeren bestehen, sind wesentliche Strukturelemente dieses Prozesses. Die transiente Maschinerie, die in der Metaphase entsteht, wenn sich die Chromosomen im Zellzentrum ausrichten, wird aufgrund ihrer Form, die wie eine Spindel eines mit Fäden bedeckten Webstuhls ist, als mitotische Spindel bezeichnet (Abbildung 1A). Es ist in vielen Organismen gut etabliert, dass Mikrotubuli in der Metaphase verwendet werden, um kondensierte Chromosomen in die Mitte der Zelle zu schieben und zu ziehen, sie auszurichten und an Mikrotubuli anzuschließen, die sie in Anaphase auseinanderziehen (Abbildung 1B, C). Die Spindel bildet sich sowohl in der Meiose (Abbildung 1B) als auch in der Mitose (Abbildung 1C) und entsteht aus vielen überlappenden Mikrotubuli, die nicht wie ein Gewinde um die zentrale Achse gewickelt sind, sondern parallel zur Grenzfläche verlaufen. Die Schaffung dieser mikrotubulibasierten Strukturen erfordert assoziierte Proteine, die vernetzen, und assoziierte Enzyme, die als Motoren fungieren können, um die Chromosomen zu drücken und zu ziehen1.
Studien an meiotischen Spindeln haben gezeigt, dass die Mikrotubuli in vernetzten Arrays 2,3,4,5,6 kurz, dynamisch und überlappend sind (Abbildung 1Di). Aufgrund der physikalischen Organisation dieser kurzen Mikrotubuli ähnelt die meiotische Spindel einem Flüssigkristall-Tactoid (Abbildung 1E). Tatsächlich wurde gezeigt, dass Spindeln verschmelzen und verschmelzen, wie man es von Flüssigkristall-Tactoidenerwarten würde 5.
Viele Studien aus den 1960er Jahren haben Fixierung, serielle Schnitte und Elektronenmikroskopie verwendet, um festzustellen, dass es zwei Arten von Mikrotubuli in der mitotischen Spindel 7,8,9,10 gibt. Der erste Typ wird als Kinetochor-Mikrotubuli bezeichnet, die den Spindelpol mit dem Kinetochor verbinden. Der zweite Typ wird als interpolare oder polare Mikrotubuli bezeichnet, die über die Chromosomen hinauswachsen und sich in der Mitte überlappen (Abbildung 1Dii) 8,9,10. Ein dritter Typ werden als astrale Mikrotubuli bezeichnet, die sich außerhalb der Spindel befinden und die Pole mit dem Zellrand verbinden; Diese Mikrotubuli-Organisationen liegen außerhalb des Rahmens der aktuellen Diskussion. Es gibt neuere Studien über die Wechselwirkung zwischen Augmin6 und Gamma-Tubulin-Ringkomplex, der Keimbildungszentren für Mikrotubuli beeinflusst, was zu einer mitotischen Spindel mit kürzeren Mikrotubuli wie in Abbildung 1D führt.
Da Mikrotubuli länger als breit sind, mit einem hohen Aspektverhältnis und einer hohen Steifigkeit, sind sie wie vergrößerte Versionen von Flüssigkristallmolekülen. In der Physik der weichen Materie wurden Atome und Moleküle unter Verwendung minimaler Wechselwirkungen angenähert, um die physikalischen Mechanismen von Phasenübergängen, einschließlich Keimbildung und Schmelzen von Kristallen11, abzuleiten. In ähnlicher Weise sind Mikrotubuli mesoskalige Objekte, die vergrößerte Versionen von Flüssigkristallmolekülen sind und Einblicke in die Physik der Flüssigkristalldynamik geben, einschließlich der Keimbildung und des Wachstums der nematischen Phasen aus isotropen. Darüber hinaus weist die meiotische Spindel, wie oben diskutiert, Eigenschaften wie die eines Flüssigkristall-Tactoids auf, eines nematischen Zustands, der aus dem isotropen Zustand von Flüssigkristallmolekülen 3,4,5 keimt und wächst. Für Tactoide sind Keimbildung und Wachstum wie bei anderen Kristallen (d.h. sie erfordern eine relativ hohe Konzentration an Mesogenen [den Molekülen, die Flüssigkristalle bilden]). Die einzigartige “Spindelform” des Tactoiden ergibt sich aus der lokalen Ausrichtung der Flüssigkristallmesogene, die sich in der nematischen Phase ausrichten (Abbildung 1E). Sie können keinen abgerundeten Kristall bilden, da die Moleküle stark asymmetrisch sind. Angesichts der Beschaffenheit der Mikrotubuli ist es vielleicht nicht verwunderlich, dass die mitotische Spindelmaschinerie, die aus einer hohen lokalen Konzentration von Mikrotubuli besteht, auch die gleiche Form hat, unabhängig davon, ob sie als Tactoid oder Spindel bezeichnet wird. Taktoide können bipolar sein, mit Polen an den sich verjüngenden Enden (Abbildung 1Ei), oder homogen, mit Polen effektiv im Unendlichen (Abbildung 1Eii).
Angesichts der Bedeutung der Spindelbildung wurden Bemühungen um eine selbstorganisierte Spindelbildung in vitro unternommen, indem die Kondensation von Mikrotubuli in Bündel über ionische Spezies 12,13, Crowding-Agenten, die Depletionsinteraktionen erzeugen 14,15, und spezifische Mikrotubuli-Vernetzungsproteine13,16,17,18,19 nachgewiesen wurde. 21. Obwohl diese Mittel alle daran arbeiten, die lokale Konzentration von Mikrotubuli zu erhöhen, führen sie überraschenderweise oft zu langen Mikrotubulibündeln, aber nicht zu Tactoiden. Ein Grund, warum diese Bündel lang sind, könnte sein, dass die Mikrotubuli, aus denen sie bestehen, auch lang sind. Jüngste Arbeiten mit kürzeren Mikrotubuli berichteten auch von längeren Bündeln, die sich am Ende15 nicht verjüngen; In diesem Fall werden die Bündel mit Motorproteinen zusammengehalten, die eine Verlängerung der Bündel bewirken und sie dadurch länger machen. Für konische, spindelartige Baugruppen, wie hier beschrieben, werden kurze Mikrotubuli mit nicht-extensilen Vernetzern benötigt.
Vor kurzem haben wir eine Technik entwickelt, die die Erzeugung von Mikrotubuli-Tactoiden mit dem antiparallelen Vernetzer MAP65 in Gegenwart von nukleierenden stabilen Mikrotubuliermöglicht 22. Die Mikrotubuli mussten kurz sein, aber nur wenige bekannte Regulatoren der Mikrotubuli-Länge können Mikrotubuli gegen dynamische Instabilität oder End-to-End-Glühen kappen. Stattdessen wurde GMPCPP verwendet, um die Filamente nach dem Wachstum zu keimen und zu stabilisieren. Dies ermöglichte es, eine hohe Dichte an kurzen Mikrotubuli zu erzeugen, die sich selbst in Tactoiden organisieren konnten. Diese Tactoiden waren homogen, wenn sie unter Doppelbrechung betrachtet wurden. Zusätzlich zu kurzen Mikrotubuli wurde ein spezifischer antiparalleler Vernetzer, MAP65, verwendet, um die Tactoide zu bilden (Abbildung 2). MAP65 ist ein pflanzliches Mikrotubuli-assoziiertes Protein in der PRC1/Ase1-Familie der mitotischen Vernetzer23. MAP65 existiert als Dimer, mit einer starken Affinität zur Bindung an sich selbst sowie an die Mikrotubuli24. Im Gegensatz zu den meiotischen Spindeln und Tactoiden, die mit Aktinfilamenten 25,26,27 beobachtet wurden, die bipolar sind und die flüssigkeitsähnlichen Eigenschaften von Flüssigkristallen aufweisen, wurde beobachtet, dass Mikrotubuli-Tactoide fest wie 22,28 sind.
Hier werden Protokolle zur Herstellung der Mikrotubuli-Tactoide und zur Charakterisierung der Form der Baugruppen und der Mobilität der Bestandteile mit fluoreszenzbasierten Techniken vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden wurden in mehreren Arbeiten zur Erzeugung von Mikrotubuli-Tactoiden verwendet (Abbildung 2)22,28. Diese Experimente sind biologisch relevant, um die Organisationsprinzipien aufzudecken, die die Form und Stabilität der mitotischen oder meiotischen Spindel in den meisten Zelltypen kontrollieren. Darüber hinaus sind Mikrotubuli Modell-Flüssigkristallmesogene, die helfen können, mehr darüber zu erfahren, wie Flüssigkristalle keimen und nematische Phasen aus isotropen Phasen wachsen lassen.
Das hier beschriebene Verfahren hat mehrere Vorteile für die Erforschung der Mikrotubuli-Selbstorganisation. Erstens ist es sehr reproduzierbar, da es im Labor von vielen Studenten, einschließlich Gymnasiasten, mit wenig Vorwissen oder Training durchgeführt wurde, bevor es im Labor begann. Die Taktoide sind doppelbrechend22, so dass sie zusätzlich zur Fluoreszenzmikroskopie im Durchlichtlicht betrachtet werden können, wodurch diese Methode vielen Labors zugänglich ist und dieses experimentelle Verfahren neben der High-End-Forschung auch für Bildungszwecke angepasst werden kann. Schließlich eröffnet dieser Prozess Wege, um biologische Systeme in einem reduzierten, reduktionistischen Ansatz weiter zu verstehen und zu untersuchen, so dass man verstehen kann, wie jede zusätzliche Bedingung, jedes Protein oder jeder Zusatzstoff die Selbstorganisation von Tactoiden und vielleicht letztendlich die Spindel verändern kann. Ziele für eine bessere Biomimikry sind Aktivität, Fließfähigkeit und Filamentpolaritätssortierung.
Es kann mehrere Faktoren geben, die das Experiment beeinflussen und unerwartete Ergebnisse liefern. Wenn sich beispielsweise die Tactoide nicht bilden (Abbildung 2), aber fächerartige Muster beobachtet werden, ist der MAP65 wahrscheinlich nicht vorhanden oder bindet nicht an die Mikrotubuli22,28. Dies sollte auch im MAP65-Fluoreszenzkanal offensichtlich sein, da der GFP-MAP65 nicht an die Mikrotubuli gebunden ist.
Wenn sich die Tactoide nicht bilden und der Hintergrund als Flecken auf dem Glas erscheint, könnte dies an der Oberflächenbeschichtung liegen. Einmal durchgeführt, dauert die Silanisierung nur 1 Monat auf Deckgläsern. Wenn es nachlässt, kann sich das Tubulin unspezifisch an die exponierte Oberfläche binden. Diese Bindung erfolgt in ungeraden Mustern.
Wenn sich die Tactoide nicht bilden und das Tubulin in Aggregaten verschiedener Formen und Größen beobachtet wird, könnte dies auf Tubulin von schlechter Qualität zurückzuführen sein. Tubulin kann zentrifugiert werden, um anfängliche Aggregate zu entfernen, die diese Off-Pathway-Aggregation anstelle der Mikrotubuli-Polymerisation antreiben können. Wenn die Oberfläche an das Tubulin bindet, kann sie auch das Tubulin in der Lösung abbauen. Niedrige Konzentrationen von Tubulin, unterhalb der kritischen Konzentration für die Polymerisation von Mikrotubuli, können zu Aggregaten führen.
Wenn der MAP65-Kanal in FRAP-Experimenten keine Erholung zeigt (Abbildung 5), ist es möglich, dass die Photobleiche die Mikrotubuli photoschädlich gemacht hat. Lichtschäden verursachen die lokalisierte Zerstörung der Filamente. Dies kann durch Untersuchung im Sendekanal überprüft werden. Mikrotubuli-Tactoide sind im übertragenen Kanal durch einen hohen Index der Brechungsfehlanpassung mit dem umgebenden Wasser sichtbar. Lichtinduzierte Lichtschäden treten als Brandmarke oder Kontrastverlust in der Durchlichtbildgebung am Ort des ROI auf, der einer Photobleiche unterzogen wird. Tritt dies ein, muss die Laser- oder Lichtleistung reduziert werden, um die Lichtschädigung der Proteine zu hemmen.
Bei diesem Verfahren und Ansatz gab es mehrere Herausforderungen. Ein Problem ist, dass die Längenmessungen derzeit von Hand durch Klicken auf das Bild durchgeführt werden. Diese Methode ist zwar unkompliziert, kann aber zu einer hohen Unsicherheit führen. Die Breitenmessung, die den Querschnitt und die Anpassung an einen Gaußschen Wert verwendet, ist eine bessere Methode zur Quantifizierung der Größe. Eine ähnliche Methode könnte für die Länge verwendet werden. Ein zweites Problem ist, dass sich die Tactoide, weil sie so lang und dünn sind, manchmal biegen können. Dies erschwert die Quantifizierung der Länge. Die Konturlänge kann mit einer segmentierten Linie quantifiziert werden, aber jedes Mal, wenn ein Segment hinzugefügt wird, kommt es zu einer zusätzlichen Unsicherheit.
Aus wissenschaftlicher Sicht hat dieser Ansatz einige andere Herausforderungen für seine Verwendung als Modell für Flüssigkristalle oder Spindeln. Die erste Herausforderung war die lange, dünne Form der Tactoide, die Mikrotubuli erzeugen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Wie in früheren Veröffentlichungen22 erwähnt, sind Mikrotubuli-Tactoide homogene Tactoide, keine bipolaren. Dies bedeutet, dass die Mikrotubuli, aus denen die Form besteht, nicht neu ausgerichtet werden, um auf die Spitzen der Struktur zu zeigen. Stattdessen befinden sich alle Mikrotubuli parallel zur Längsachse und die “Pole” befinden sich im Unendlichen. Dies unterscheidet sich stark von den Tactoiden, die für molekulare Flüssigkristalle oder sogar für Aktin oder DNA beobachtet wurden, die auch als Flüssigkristallmesogene wirken können. In diesen anderen Systemen sind die Tactoiden bipolar und zeigen, wenn sie in gekreuzten Polarisatoren betrachtet werden, die verräterischen Anzeichen einer Neuorientierung der Stäbe.
Eine zweite große Herausforderung in diesem System besteht darin, dass die Mikrotubuli im Inneren des Tactoiden unbeweglich sind. Dies geht aus FRAP-Experimenten und -Analysen hervor, da die Rückgewinnung der Mikrotubuli sehr gering ist. Ihre feststoffartige Natur macht Mikrotubuli-Tactoide weniger wertvoll als großflächige Flüssigkristallanaloga. Die nematische Phase eines Flüssigkristalls sollte sowohl flüssige (flüssige) als auch kristalline (organisierte) Eigenschaften haben. Obwohl die Form für die Spindel richtig erscheint, macht die Unbeweglichkeit das System weniger aufregend als eine mitotische Modellspindel. Auf der anderen Seite bietet dieses Problem Möglichkeiten zu untersuchen, wie man die Experimente modifizieren kann, um mehr Flüssigkeit im System zu schaffen.
Diese wissenschaftlichen Herausforderungen bieten spannende Möglichkeiten, die neue Erkenntnisse über das System ermöglichen. Um die Mikrotubuli-Tactoide bipolarer zu machen, könnte man kürzere Mikrotubuli verwenden. Es gibt jedoch eine zusätzliche Herausforderung, da Mikrotubuli nicht viele gut charakterisierte Capping-Proteine haben, um die Länge wie Aktin zu kontrollieren. Die Verwendung von Keimbildung und Wachstum erfordert die Verwendung sehr hoher Konzentrationen von Tubulin und GMPCPP, um kurze Mikrotubuli herzustellen. Die hohe Tubulinkonzentration führt zu einer größeren Anzahl von Filamenten im System, was es schwieriger macht, Tactoide voneinander zu trennen. Das Hinzufügen neuer Mikrotubuli-Verschließer, wie DARPin33, kann in dieser Situation helfen. Das zweite Problem, dass die Mikrotubuli unbeweglich sind, könnte durch die Zugabe von Motorproteinen wie Kinesin-534, die Tetramere von Motoren sind, die in der Mitose verwendet werden, gemildert werden. Alternativ könnten künstliche Dimere von dimerem Kinesin-115 verwendet werden.
Eine andere Möglichkeit, mehr Flüssigkeit hinzuzufügen, wäre, den Mikrotubuli zu erlauben, ihre dynamische Instabilität, das Wachstum und Schrumpfen von Mikrotubuli, durchzuführen. Derzeit sind Mikrotubuli, die mit stabilen GMPCPP-Filamenten ausgesät werden und dann eine dynamische Instabilität erfahren, viel länger als gewünscht, um eine Spindel oder einen Tactoid zu bilden, was zu sehr langen Organisationen wie Fans oder Bündeln führen würde. Das Hinzufügen von dynamischer Instabilität des Mikrotubuli müsste also sorgfältig durchgeführt werden, um die taktoide Form zu erhalten. Die Zugabe von assoziierten Proteinen und Enzymen, die die Länge kontrollieren können, kann dieses Problem mildern. Zum Beispiel wäre wahrscheinlich eine Depolymerisation von Kinesinen wie Kinesin-1335 oder die Trennung von Enzymen wie Katanin36 erforderlich. Diese Experimente sind komplex und schwierig, obwohl sie sehr aufschlussreich wären, egal was die Ergebnisse zeigen. Unabhängig davon, in welche Richtung zukünftige Experimente gehen, kann die hier entwickelte Plattform zur Herstellung von Mikrotubuli-Tactoiden neue Informationen über die physikalische Grundlage der Mikrotubuli-Organisation freilegen.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten allen Mitgliedern des Ross Lab im Sommer 2021, insbesondere K. Alice Lindsay, für ihre Hilfe danken. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NSF BIO-2134215 unterstützt, der S. Sahu, N. Goodbee, HB Lee und J.L. Ross unterstützte. Ein Zuschuss der KECK Foundation (Rae Anderson, USD, Lead PI) unterstützte teilweise R. Branch und P. Chauhan
Materials
| 2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
| 5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
| Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
| BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
| Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
| Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
| EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
| Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
| Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
| Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
| Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
| Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
| Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
| Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
| Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
| Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
| GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
| Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
| Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
| Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
| KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
| Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
| MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
| MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
| NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
| Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
| PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
| Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
| Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
| PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
| Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
| Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
| Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
| Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
| Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
参考文献
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).
- Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. Oocyte meiotic spindle assembly and function. Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).
- Brugués, J., Needleman, D. Physical basis of spindle self-organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).
- Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles. Cell. 149 (3), 554-564 (2012).
- Gatlin, J. C., et al. Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules. Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).
- Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle. Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).
- Inoue, S., Sato, H. Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules. Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).
- Allenspach, A. L., Roth, L. E. Structural variations during mitosis in the chick embryo. Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).
- Theg, D. E. Cytoplasmic microtubules in different animal cells. Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).
- Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare. Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).
- Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. . Principles of Condensed Matter Physics. , (1995).
- Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines. Biophysical Journal. 101 (1), 205 (2011).
- Needleman, D. J., et al. Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).
- Ross, J. L., Fygenson, D. K. Mobility of taxol in microtubule bundles. Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).
- Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. Cilia-like beating of active microtubule bundles. Science. 333 (6041), 456-459 (2011).
- Brandt, R., Lee, G. Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).
- Hirokawa, N. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).
- MacRae, T. H. Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).
- She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly. Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).
- Walczak, C. E., Shaw, S. L. A MAP for Bundling Microtubules. Cell. 142 (3), 364-367 (2010).
- Edozie, B., et al. Self-organization of spindle-like microtubule structures. Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).
- Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling. Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).
- Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).
- Scheff, D. R., et al. Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments. Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).
- Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).
- Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).
- Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. Crowder and surface effects on self-organization of microtubules. Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).
- Stanhope, K. T., Ross, J. L. Microtubules, MAPs, and motor patterns. Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).
- Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg (2022)
- Lantzsch, I., et al. Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans. eLife. 10, 58903 (2021).
- Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60. Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).
- Pecqueur, L., et al. A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).
- Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
- Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP. Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).
- McNally, F. J., Vale, R. D. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell. 75 (3), 419-429 (1993).
