Imagem 3D quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células T em órgãos esclarecidos intactos

A doença de Chagas, causada pelo parasita protozoário T. cruzi, está entre as doenças tropicais mais negligenciadas do mundo, causando aproximadamente 13.000 mortes anuais. A infecção muitas vezes progride de um estágio agudo para um estágio crônico produzindo patologia cardíaca em 30% dos pacientes, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita ^1,2. Apesar da forte resposta imune hospedeira provocada contra o parasita durante a fase aguda, o baixo número de parasitas cronicamente persiste ao longo da vida do hospedeiro em tecidos como o coração e o músculo esquelético. Vários fatores, incluindo o início atrasado das respostas imunes adaptativas e a presença de formas não replicantes do parasita, podem contribuir para a capacidade de T. cruzi para evitar uma eliminação completa pelo sistema imunológico 3,4,5,6. Além disso, as formas dormentes não replicadas do parasita apresentam baixa suscetibilidade aos fármacos trypanocidas e podem, em parte, ser responsáveis pela falha de tratamento observada em muitos casos ^7,8.

O desenvolvimento de novas técnicas de imagem proporciona uma oportunidade de obter uma visão sobre a distribuição espacial dos parasitas nos tecidos infectados e sua relação com as células imunes envolvidas em seu controle. Essas características são cruciais para uma melhor compreensão dos processos de controle de parasitas pelo sistema imunológico e rastreamento dos raros parasitas dormentes presentes nos tecidos crônicos.

A microscopia de fluorescência de folhas de luz (LSFM) é um dos métodos mais abrangentes e imparcial para imagens 3D de grandes tecidos ou órgãos sem secção fina. Microscópios de folha de luz utilizam uma fina folha de luz para apenas excitar os fluoroforos no plano focal, reduzir o fotobleaching e a fototoxicidade das amostras, e gravar imagens de milhares de camadas de tecido usando câmeras ultrarrápidas. O alto nível de transparência tecidual necessário para a penetração adequada da luz laser nos tecidos é obtido pela homogeneização do índice de refração (RI) após a delipidação e descoloração do tecido, o que reduz a dispersão da luz e torna imagens de alta qualidade ^9,10,11.

Abordagens de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para a imagem de camundongos inteiros 12,13,14, organoides 15,16,17, órgãos expressando marcadores fluorescentes repórteres 18,19,20,21,22,23, e recentemente um número limitado de tecidos humanos²⁴ . Os métodos atuais de limpeza tecidual são classificados em três famílias: (1) métodos orgânicos à base de solventes, como os protocolos DISCO ^25,26, (2) métodos à base de hidrogel, como CLARITY²⁷, e métodos aquosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis)18,19,28,29 . Os protocolos CÚBICOS mantêm a forma dos órgãos e a integridade dos tecidos, preservando a fluorescência das proteínas de repórteres expressas endógenamente. A atualização mais recente desta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), também permite a detecção de epítopos usando anticorpos fluorescentes e rotulagem de DNA²⁸.

No presente protocolo, utilizou-se o pipeline CUBIC para detecção de T. cruzi expressando proteínas fluorescentes em tecidos de camundongos intactos esclarecidos. Os tecidos opticamente transparentes foram imagens LSFM, reconstruídas em 3D, e o número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes dormentes e células T por órgão foram automaticamente quantificados. Além disso, este protocolo foi adotado com sucesso para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares. Essas abordagens são essenciais para a compreensão da expansão e controle de T. cruzi em hospedeiros infectados e são úteis para avaliar plenamente a quimioterapia e a imunoterapia para a doença de Chagas.