트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징
概要
본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Abstract
샤 가스 병은 주로 라틴 아메리카에서 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 무시 된 병리학입니다. 샤가스병 치료제인 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)는 인간을 포함한 여러 포유류 종을 감염시켜 심장 및 소화기 병리를 유발하는 다양한 생물학을 가진 절대 세포 내 기생충입니다. 샤가스병의 복잡한 생물학을 이해하고 치료 요법의 결과를 정확하게 평가하기 위해서는 T. cruzi in vivo 감염의 신뢰할 수 있는 검출이 오랫동안 요구되어 왔습니다. 현재 프로토콜은 3D 재구성 및 제거 된 장기에서 T. cruzi 감염 세포의 자동 정량화를위한 통합 파이프 라인을 보여줍니다. 라이트 시트 형광 현미경을 사용하면 전체 장기 또는 조직에서 활발하게 증식하고 휴면 상태인 T. cruzi 기생충과 면역 이펙터 세포를 정확하게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 또한 항체 및 핵 염색으로 제거 된 장기의 균일 한 표지를 얻기위한 CUBIC-HistoVision 파이프 라인이 성공적으로 채택되었습니다. 3D 면역염색과 결합된 조직 투명화는 약물 치료 프로토콜을 종합적으로 평가하고 T. cruzi 감염 조직의 세포 조직에 대한 이해를 향상시키는 편견 없는 접근 방식을 제공하며 샤가스병의 항-T. 크루즈 면역 반응, 조직 손상 및 복구와 관련된 발견을 발전시킬 것으로 기대됩니다.
Introduction
원생동물 기생충 T. cruzi에 의해 발생하는 샤가스병은 세계에서 가장 방치된 열대성 질병 중 하나이며 연간 약 13,000명이 사망합니다. 감염은 종종 부정맥, 심부전 및 갑작스런 사망을 포함하여 환자의 30 %에서 심장 병리를 일으키는 급성에서 만성 단계로 진행됩니다 1,2. 급성기 동안 기생충에 대해 유도 된 강력한 숙주 면역 반응에도 불구하고, 적은 수의 기생충이 심장 및 골격근과 같은 조직에서 숙주의 평생 동안 만성적으로 지속됩니다. 적응 면역 반응의 지연된 발병 및 비 복제 형태의 기생충의 존재를 포함한 몇 가지 요인은 면역계 3,4,5,6에 의한 완전한 제거를 피하기 위해 T. cruzi의 능력에 기여할 수 있습니다. 또한, 복제되지 않는 휴면 형태의 기생충은 트리파노시드 약물에 대한 낮은 감수성을 나타내며 많은 경우 7,8에서 관찰되는 치료 실패의 원인이 될 수 있습니다.
새로운 이미징 기술의 개발은 감염된 조직에서 기생충의 공간적 분포와 통제에 관여하는 면역 세포와의 관계에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 특성은 면역 체계에 의한 기생충 제어 과정을 더 잘 이해하고 만성 조직에 존재하는 희귀 휴면 기생충을 추적하는 데 중요합니다.
라이트 시트 형광 현미경(LSFM)은 얇은 절편 없이 큰 조직 또는 장기의 3D 이미징을 위한 가장 포괄적이고 편견 없는 방법 중 하나입니다. 라이트 시트 현미경은 얇은 빛의 시트를 사용하여 초점면의 형광단만 여기시키고, 샘플의 광퇴색 및 광독성을 줄이며, 초고속 카메라를 사용하여 수천 개의 조직층의 이미지를 기록합니다. 조직에서 레이저 광의 적절한 침투에 필요한 높은 수준의 조직 투명성은 조직 지질 화 및 탈색 후 굴절률 (RI)을 균질화하여 얻어지며, 이는 빛의 산란을 줄이고 고품질 이미지를 렌더링합니다 9,10,11.
조직 투명화 접근법은 전체 마우스12,13,14, 오가노이드15,16,17, 리포터 형광 마커를 발현하는 기관 18,19,20,21,22,23, 및 최근에는 제한된 수의 인간 조직(24)의 이미징을 위해 개발되었습니다. . 조직 청소를 위한 현재의 방법은 세 가지 제품군으로 분류됩니다: (1) DISCO 프로토콜25,26과 같은 유기 용매 기반 방법, (2) CLARITY 27과 같은 하이드로겔 기반 방법 및 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 이미징 칵테일 및 전산 분석)18,19,28,29와 같은 수성 방법 . CUBIC 프로토콜은 장기 모양과 조직 무결성을 유지하여 내인성으로 발현된 리포터 단백질의 형광을 보존합니다. 이 기술의 가장 최근의 업데이트인 CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV)은 또한 형광-표지된 항체 및 DNA 표지28을 사용하여 에피토프의 검출을 허용한다.
본 프로토콜에서, 정제된 무손상 마우스 조직에서 형광 단백질을 발현하는 T. cruzi 를 검출하기 위한 CUBIC 파이프라인을 사용하였다. 광학적으로 투명한 조직을 LSFM 이미지화하고 3D로 재구성했으며 장기 당 T. cruzi 감염 세포, 휴면 무명 및 T 세포의 정확한 총 수를 자동으로 정량화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 항체 및 핵 얼룩이 있는 투명화된 장기의 균일한 표지를 얻기 위해 성공적으로 채택되었습니다. 이러한 접근법은 감염된 숙주에서 T. cruzi 의 확장 및 제어를 이해하는 데 필수적이며 샤 가스 병에 대한 화학 및 면역 치료제를 완전히 평가하는 데 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기생충과 면역 반응에 대한 광범위한 전체 장기 영상의 부재는 숙주-기생충 상호 작용의 복잡성에 대한 이해를 제한하고 샤가스병에 대한 치료법의 평가를 방해합니다. 본 연구는 T. cruzi에 감염된 마우스의 손상되지 않은 장기와 조직을 명확히하고 염색하기 위해 CUBIC 파이프 라인을 채택했습니다.
이 연구에서 여러 조직 투명화 프로토콜이 테스트되었습니다 (PACT<sup cl…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
조직 투명화 및 면역염색 프로토콜에 관한 귀중한 도움과 권장 사항에 대해 Etsuo Susaki 박사에게 감사드립니다. 또한 LSFM 및 컨포칼 이미징을 사용한 기술 지원에 대해 CTEGD Biomedical Microscopy Core의 M. Kandasamy에게 감사드립니다. 또한이 연구 전반에 걸쳐 유용한 제안을 해주신 Tarleton Research Group의 모든 구성원에게 감사드립니다.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
参考文献
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
