Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen
概要
Het huidige protocol beschrijft lichtblad fluorescerende microscopie en geautomatiseerde software-ondersteunde methoden om prolifererende en slapende Trypanosoma cruzi-parasieten en T-cellen in intacte, gewiste organen en weefsels te visualiseren en nauwkeurig te kwantificeren. Deze technieken bieden een betrouwbare manier om behandelingsresultaten te evalueren en bieden nieuwe inzichten in interacties tussen parasieten en gastheer.
Abstract
De ziekte van Chagas is een verwaarloosde pathologie die wereldwijd miljoenen mensen treft, voornamelijk in Latijns-Amerika. De ziekteverwekker van Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is een obligate intracellulaire parasiet met een gevarieerde biologie die verschillende zoogdiersoorten infecteert, waaronder mensen, waardoor cardiale en spijsverteringspathologieën ontstaan. Betrouwbare detectie van T. cruzi in vivo infecties is al lang nodig om de complexe biologie van de ziekte van Chagas te begrijpen en de uitkomst van behandelingsregimes nauwkeurig te evalueren. Het huidige protocol demonstreert een geïntegreerde pijplijn voor geautomatiseerde kwantificering van T. cruzi-geïnfecteerde cellen in 3D-gereconstrueerde, gewiste organen. Light-sheet fluorescerende microscopie maakt het mogelijk om actief prolifererende en slapende T. cruzi-parasieten en immuuneffectorcellen in hele organen of weefsels nauwkeurig te visualiseren en te kwantificeren. Ook werd de CUBIC-HistoVision-pijplijn voor het verkrijgen van uniforme etikettering van geruimde organen met antilichamen en nucleaire vlekken met succes aangenomen. Weefselopruiming in combinatie met 3D-immunostaining biedt een onbevooroordeelde benadering om geneesmiddelenbehandelingsprotocollen uitgebreid te evalueren, het begrip van de cellulaire organisatie van T. cruzi-geïnfecteerde weefsels te verbeteren en zal naar verwachting ontdekkingen bevorderen met betrekking tot anti-T. cruzi immuunresponsen, weefselschade en reparatie bij de ziekte van Chagas.
Introduction
De ziekte van Chagas, veroorzaakt door de protozoaire parasiet T. cruzi, is een van ‘s werelds meest verwaarloosde tropische ziekten en veroorzaakt ongeveer 13.000 jaarlijkse sterfgevallen. De infectie evolueert vaak van een acuut naar een chronisch stadium dat cardiale pathologie produceert bij 30% van de patiënten, waaronder aritmieën, hartfalen en plotselinge dood 1,2. Ondanks de sterke immuunrespons van de gastheer die tijdens de acute fase tegen de parasiet werd opgewekt, blijven lage aantallen parasieten chronisch bestaan gedurende het hele leven van de gastheer in weefsels zoals het hart en de skeletspieren. Verschillende factoren, waaronder het vertraagde begin van adaptieve immuunresponsen en de aanwezigheid van niet-replicerende vormen van de parasiet, kunnen bijdragen aan het vermogen van T. cruzi om een volledige eliminatie door het immuunsysteem te voorkomen 3,4,5,6. Bovendien vertonen niet-replicerende slapende vormen van de parasiet een lage gevoeligheid voor trypanocidale geneesmiddelen en kunnen ze gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor het falen van de behandeling dat in veel gevallen wordt waargenomen 7,8.
De ontwikkeling van nieuwe beeldvormingstechnieken biedt de mogelijkheid om inzicht te krijgen in de ruimtelijke verdeling van de parasieten in de geïnfecteerde weefsels en hun relatie met de immuuncellen die betrokken zijn bij hun controle. Deze kenmerken zijn cruciaal voor een beter begrip van de processen van parasietbestrijding door het immuunsysteem en het volgen van de zeldzame slapende parasieten die aanwezig zijn in chronische weefsels.
Light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) is een van de meest uitgebreide en onbevooroordeelde methoden voor 3D-beeldvorming van grote weefsels of organen zonder dunne secties. Light-sheet microscopen gebruiken een dun vel licht om alleen de fluoroforen in het brandpuntsvlak te prikkelen, fotobleaching en fototoxiciteit van monsters te verminderen en beelden van duizenden weefsellagen op te nemen met behulp van ultrasnelle camera’s. Het hoge niveau van weefseltransparantie dat nodig is voor de juiste penetratie van het laserlicht in weefsels wordt verkregen door de brekingsindex (RI) te homogeniseren na weefseldelipidatie en ontkleuring, waardoor de verstrooiing van licht wordt verminderd en beelden van hoge kwaliteit 9,10,11 worden weergegeven.
Weefselzuiveringsbenaderingen zijn ontwikkeld voor de beeldvorming van hele muizen 12,13,14, organoïden 15,16,17, organen die reporter fluorescerende markers tot expressie brengen 18,19,20,21,22,23, en onlangs een beperkt aantal menselijke weefsels24 . De huidige methoden voor weefselzuivering zijn ingedeeld in drie families: (1) organische methoden op basis van oplosmiddelen zoals DISCO-protocollen 25,26, (2) op hydrogel gebaseerde methoden, zoals CLARITY27, en waterige methoden, zoals CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails en Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-protocollen behouden de orgaanvorm en weefselintegriteit, waardoor de fluorescentie van endogene tot expressie gebrachte reportereiwitten behouden blijft. De meest recente update van deze techniek, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), maakt ook de detectie van epitopen mogelijk met behulp van fluorescerend gelabelde antilichamen en DNA-etikettering28.
In het huidige protocol werd de CUBIC-pijplijn gebruikt voor het detecteren van T. cruzi die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt in geklaarde intacte muizenweefsels. Optisch transparante weefsels werden LSFM-beelden, 3D gereconstrueerd en het precieze totale aantal T. cruzi geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen per orgaan werden automatisch gekwantificeerd. Ook werd dit protocol met succes aangenomen om uniforme etikettering van geruimde organen met antilichamen en nucleaire vlekken te verkrijgen. Deze benaderingen zijn essentieel voor het begrijpen van de uitbreiding en controle van T. cruzi in geïnfecteerde gastheren en zijn nuttig voor het volledig evalueren van chemo- en immunotherapieën voor de ziekte van Chagas.
Protocol
Representative Results
Discussion
De afwezigheid van uitgebreide beeldvorming van het hele orgaan van parasieten en de immuunrespons beperkt het begrip van de complexiteit van de gastheer-parasietinteracties en belemmert de evaluatie van therapieën voor de ziekte van Chagas. De huidige studie heeft de CUBIC-pijplijn aangenomen om intacte organen en weefsels van T. cruzi-geïnfecteerde muizen te verduidelijken en te kleuren.
In deze studie werden meerdere weefselzuiveringsprotocollen getest (PACT32</…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Etsuo Susaki voor hun waardevolle hulp en aanbevelingen met betrekking tot weefselzuivering en immunostaining protocollen. Ook zijn we M. Kandasamy van de CTEGD Biomedical Microscopy Core dankbaar voor technische ondersteuning met behulp van LSFM en confocale beeldvorming. We bedanken ook alle leden van Tarleton Research Group voor nuttige suggesties tijdens dit onderzoek.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
参考文献
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
