概要

Количественная 3D-визуализация клеток, инфицированных Trypanosoma cruzi, спящих амастиготов и Т-клеток в интактных осветленных органах

Published: June 23, 2022
doi:

概要

Настоящий протокол описывает флуоресцентную микроскопию и автоматизированные программные методы визуализации и точной количественной оценки размножающихся и спящих паразитов Trypanosoma cruzi и Т-клеток в неповрежденных, очищенных органах и тканях. Эти методы обеспечивают надежный способ оценки результатов лечения и предлагают новое понимание взаимодействия паразита и хозяина.

Abstract

Болезнь Шагаса является забытой патологией, которая поражает миллионы людей во всем мире, в основном в Латинской Америке. Возбудитель болезни Шагаса, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), является облигатным внутриклеточным паразитом с разнообразной биологией, который заражает несколько видов млекопитающих, включая человека, вызывая сердечные и пищеварительные патологии. Надежное выявление инфекций T. cruzi in vivo уже давно необходимо для понимания сложной биологии болезни Шагаса и точной оценки результатов схем лечения. Текущий протокол демонстрирует интегрированный конвейер для автоматизированной количественной оценки клеток, инфицированных T. cruzi, в 3D-реконструированных, очищенных органах. Флуоресцентная микроскопия позволяет точно визуализировать и количественно оценивать активно размножающихся и спящих паразитов T. cruzi и иммунных эффекторных клеток в целых органах или тканях. Также был успешно принят конвейер CUBIC-HistoVision для получения равномерной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Очистка тканей в сочетании с 3D-иммуноокрашиванием обеспечивает непредвзятый подход к всесторонней оценке протоколов лечения лекарственными препаратами, улучшает понимание клеточной организации тканей, инфицированных T. cruzi, и, как ожидается, будет способствовать открытиям, связанным с иммунными реакциями против T. cruzi , повреждением тканей и восстановлением при болезни Шагаса.

Introduction

Болезнь Шагаса, вызванная простейшим паразитом T. cruzi, является одной из самых забытых тропических болезней в мире, вызывая около 13 000 ежегодных смертей. Инфекция часто прогрессирует от острой к хронической стадии, вызывая сердечную патологию у 30% пациентов, включая аритмии, сердечную недостаточность и внезапную смерть 1,2. Несмотря на сильный иммунный ответ хозяина, вызванный против паразита во время острой фазы, низкое количество паразитов хронически сохраняется на протяжении всей жизни хозяина в тканях, таких как сердце и скелетные мышцы. Несколько факторов, включая отсроченное начало адаптивных иммунных реакций и наличие нереплицирующих форм паразита, могут способствовать способности T. cruzi избегать полного устранения иммунной системой 3,4,5,6. Кроме того, невоспроизводящиеся спящие формы паразита демонстрируют низкую восприимчивость к трипаноцидным препаратам и могут частично быть ответственны за неудачу лечения, наблюдаемую во многих случаях 7,8.

Разработка новых методов визуализации дает возможность получить представление о пространственном распределении паразитов в инфицированных тканях и их взаимосвязи с иммунными клетками, участвующими в их контроле. Эти характеристики имеют решающее значение для лучшего понимания процессов борьбы с паразитами иммунной системой и отслеживания редких спящих паразитов, присутствующих в хронических тканях.

Светоплавная флуоресцентная микроскопия (LSFM) является одним из наиболее полных и непредвзятых методов для 3D-визуализации крупных тканей или органов без тонкого сечения. Световые микроскопы используют тонкий лист света, чтобы возбуждать только флуорофоры в фокальной плоскости, уменьшать фотоотбеливание и фототоксичность образцов и записывать изображения тысяч слоев тканей с помощью сверхбыстрых камер. Высокий уровень прозрачности тканей, необходимый для правильного проникновения лазерного света в ткани, получен путем гомогенизации показателя преломления (RI) после делипидации и обесцвечивания тканей, что уменьшает рассеяние света и выдаетвысококачественные изображения 9,10,11.

Разработаны подходы к очистке тканей для визуализации целых мышей 12,13,14, органоидов 15,16,17, органов, экспрессирующих репортерные флуоресцентные маркеры 18,19,20,21,22,23, а в последнее время ограниченного числа тканей человека 24 . Современные методы очистки тканей подразделяются на три семейства: (1) методы на основе органических растворителей, такие как протоколы DISCO 25,26, (2) методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY27, и водные методы, такие как CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Протоколы CUBIC поддерживают форму органа и целостность тканей, сохраняя флуоресценцию эндогенно экспрессируемых репортерных белков. Самое последнее обновление этого метода, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), также позволяет обнаруживать эпитопы с использованием флуоресцентно меченых антител и маркировки ДНК28.

В настоящем протоколе использовался конвейер CUBIC для обнаружения T. cruzi , экспрессирующих флуоресцентные белки в осветленных интактных тканях мыши. Оптически прозрачные ткани были визуализированы LSFM, реконструированы в 3D, а точное общее количество инфицированных T. cruzi клеток, спящих амастиготов и Т-клеток на орган было автоматически количественно определено. Также этот протокол был успешно принят для получения единообразной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Эти подходы необходимы для понимания расширения и контроля T. cruzi у инфицированных хозяев и полезны для полной оценки химио- и иммунотерапевтических средств для болезни Шагаса.

Protocol

Это исследование было проведено в строгом соответствии с Политикой Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Руководством Ассоциации по оценке и аккредитации аккредитации по уходу за лабораторными животными. Протокол использов…

Representative Results

Фиксированные ткани CUBIC промывали PBS для удаления фиксаторов, а затем инкубировали с коктейлями CUBIC-L, основным буферным раствором аминоспиртов, которые извлекают пигменты и липиды из ткани, что приводит к обесцвечиванию ткани при сохранении тканевой архитектуры. Линии сетки на бумаге м…

Discussion

Отсутствие обширной визуализации целых органов паразитов и иммунного ответа ограничивает понимание сложности взаимодействий хозяина и паразита и затрудняет оценку методов лечения болезни Шагаса. В настоящем исследовании был принят конвейер CUBIC для осветления и окрашивания неповреж…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Эцуо Сусаки за ценную помощь и рекомендации относительно протоколов очистки тканей и иммуноокрашивания. Кроме того, мы благодарны М. Кандасами из CTEGD Biomedical Microscopy Core за техническую поддержку с использованием LSFM и конфокальной визуализации. Мы также благодарим всех членов Исследовательской группы Тарлтона за полезные предложения на протяжении всего этого исследования.

Materials

1-methylimidazole Millipore Sigma 616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine TCI D1876
6-wells cell culture plates ThermoFisher Scientific 140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 Chromotek gb2AF647-50
anti-RFP Rockland 600-401-379
anti-α-SMA Sigma A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide ThermoFisher Scientific B3582
Bovine serum albumin (BSA) Sigma #A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse The Jackson Laboratory Strain #032080 Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO Sigma #C2278
Cleaning wipes Kimwipes  Kimberly-Clark T8788
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit TCI C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit TCI C3698
CUBIC-L TCI T3740
CUBIC-P TCI T3782
CUBIC-R+ TCI T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue Scotch 571605
DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium Biotium #60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Millipore Sigma 60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL Corning CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL Corning CLS430290
Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Heparin ThermoFisher Scientific J16920.BBR
Hyaluronidase Sigma #H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64 BitPlane v9.2.0
Imaris software BitPlane v9.3
ImSpector software LaVision BioTec, Miltenyi Biotec v6.7
Intravenous injection needle 23-G Sartori, Minisart Syringe filter 16534
Kimwipes lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope Miltenyi Biotec ULtramicroscope II imaging system
Methanol ThermoFisher Scientific 041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL Axygen T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser Fisher Scientific, Fisherbrand 03-692-172
Mounting Solution TCI M3294
N-butyldiethanolamine TCI B0725
Nicotinamide TCI N0078
N-Methylnicotinamide TCI M0374
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain Biotium #40061
Sacrifice Perfusion System Leica 10030-380
Scissors Fine Science Tools 91460-11
Serological pipettes Costar Sterile 4488
Shaking incubator TAITEC BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3) ThermoFisher Scientific 447815000
Sodium carbonate (Na2CO3) ThermoFisher Scientific L13098.36
Sodium Chloride (NaCl) ThermoFisher Scientific 447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) ThermoFisher Scientific 014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

参考文献

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).

Play Video

記事を引用
Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M., Bustamante, J. M., Hawkins, C. W. D., Tarleton, R. L. Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs. J. Vis. Exp. (184), e63919, doi:10.3791/63919 (2022).

View Video