Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace

La recherche biomédicale améliore notre compréhension de la santé et des maladies humaines grâce au développement de nouvelles technologies. L’imagerie à haute résolution transforme notre vision du nanomonde – nous permettant d’étudier les cellules et les molécules dans les moindres détails 1,2,3,4,5. L’information statique des composants dynamiques tels que les polymères mous, les assemblages de protéines ou les virus humains ne révèle qu’un instantané limité de leur récit complexe. Pour mieux comprendre le fonctionnement des entités moléculaires, leur structure et leur fonction doivent être étudiées conjointement.

Les progrès récents dans la production de matériaux tels que le graphène atomiquement mince ou les micropuces à base de silicium offrent de nouvelles possibilités d’analyse structure-fonction en temps réel à l’aide de microscopes électroniques à transmission (MET). Ces matériaux peuvent créer des chambres hermétiquement scellées pour l’imagerie EM en direct 6,7,8,9,10,11. Le nouveau champ de liquide-EM, le corrélat à température ambiante à cryo-EM, fournit des vues sans précédent des matériaux durs ou mous en solution, permettant aux scientifiques d’étudier simultanément la structure et la dynamique de leur échantillon. Les applications EM liquides comprennent des enregistrements en temps réel de nanoparticules thérapeutiques interagissant avec les cellules souches cancéreuses ainsi que des changements dans les subtilités moléculaires des pathogènes viraux^12,13,14.

Tout comme les progrès méthodologiques ont stimulé la révolution de la résolution dans le domaine de la cryo-EM, de nouvelles techniques et méthodes sont nécessaires pour étendre l’utilisation de la ME liquide en tant qu’outil à haut débit pour la communauté scientifique. L’objectif global des méthodes présentées ici est de rationaliser les protocoles de préparation des échantillons liquides. La raison d’être des techniques développées est d’utiliser de nouvelles conceptions de micropuces et de dispositifs de chargement automatique, adaptés à la collecte de données liquides et cryo-EM (Figure 1)7,14,15,16,17. Les assemblages sont scellés mécaniquement à l’aide de clips de grille standard pour les instruments automatisés, tels que le Krios, qui peut accueillir plusieurs échantillons par session ou un TEM F200C (Figure 2). Cette méthodologie étend l’utilisation de l’imagerie haute résolution au-delà des applications cryo-EM standard, démontrant des objectifs plus larges pour l’analyse des matériaux en temps réel.

Dans le présent article vidéo, des protocoles sont présentés pour la préparation d’assemblages de virus dans un liquide avec et sans porte-échantillons disponibles dans le commerce. En utilisant le porte-échantillon spécialisé pour les échantillons liquides-EM, les échantillons liquides minces peuvent fournir des informations structurelles comparables aux échantillons cryo-EM, ainsi que des informations dynamiques sur les échantillons. Des méthodes de préparation d’échantillons liquides à l’aide d’outils de chargement automatique pour les routines à haut débit ont également été démontrées. Le principal avantage par rapport aux autres techniques est que la production automatisée d’échantillons permet à l’utilisateur d’évaluer rapidement ses échantillons pour une épaisseur et un dosage d’électrons optimaux avant la collecte des données. Cette technique de criblage identifie rapidement les zones idéales pour les enregistrements en temps réel dans un liquide ou de la glace^12,14,18,19. Aux fins de la détermination de la structure 3D, la solution EM liquide peut compléter les méthodes cryo-EM établies de longue date mises en œuvre dans la cryo-EM. Les lecteurs utilisant des technologies conventionnelles de GDT ou de cryo-EM peuvent envisager d’utiliser des flux de travail liquide-EM pour fournir de nouvelles observations dynamiques de leurs échantillons d’une manière qui complète leurs stratégies actuelles.

Les échantillons de virus utilisés dans ce protocole comprennent le virus adéno-associé purifié de sous-type 3 (AAV) obtenu en cadeau et cultivé dans des conditions standard¹². Des assemblages sous-viraux non infectieux du SRAS-CoV-2 dérivés du sérum de patients atteints de COVID-19¹² et obtenus d’une source commerciale ont également été utilisés. Enfin, des particules à double couche (DLP) purifiées du rotavirus simien (souche SA11) ont été obtenues dans le laboratoire du Dr Sarah M. McDonald Esstman à l’Université de Wake Forest et cultivées en utilisant des conditions standard ^6,17. Les progiciels décrits ici sont disponibles gratuitement et les liens ont été fournis dans la section Tableau des matériaux.