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がん研究

Maintien ex vivo de la diversité cellulaire du glioblastome humain à l’aide d’une culture organoïde tridimensionnelle

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/63745
, , ,
1Department of Neurological Surgery,Cleveland Clinic, 2Cardiovascular and Metabolic Sciences,Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

概要

Ici, nous décrivons une méthode de génération d’organoïdes de glioblastome (GBM) à partir d’échantillons primaires de patients ou de cultures cellulaires dérivées de patients et de les maintenir jusqu’à maturité. Ces organoïdes GBM contiennent des populations cellulaires phénotypiquement diverses et recréent des microenvironnements tumoraux ex vivo.

Abstract

Le glioblastome (GBM) est le cancer primitif malin du cerveau le plus fréquent et de pronostic extrêmement sombre. La diversité cellulaire et moléculaire intra-tumorale, ainsi que les interactions complexes entre les microenvironnements tumoraux, peuvent rendre difficile la recherche de traitements efficaces. Les méthodes traditionnelles de culture adhésive ou sphérique peuvent masquer de telles complexités, tandis que la culture organoïde tridimensionnelle peut récapituler les gradients microenvironnementaux régionaux. Les organoïdes sont une méthode de culture GBM tridimensionnelle qui imite mieux l’architecture tumorale des patients, contient des populations cellulaires phénotypiquement diverses et peut être utilisée pour des expériences à débit moyen. Bien que la culture organoïde tridimensionnelle soit plus laborieuse et plus longue que la culture traditionnelle, elle offre des avantages uniques et peut servir à combler le fossé entre les systèmes in vitro et in vivo actuels. Les organoïdes se sont imposés comme des outils inestimables dans l’arsenal des biologistes du cancer pour mieux comprendre le comportement tumoral et les mécanismes de résistance, et leurs applications ne font que croître. Ici, des détails sont fournis sur les méthodes de génération et de maintenance des organoïdes GBM. Des instructions sur la façon d’effectuer l’incorporation et la section d’échantillons organoïdes à l’aide de techniques d’enrobage congelé et d’enrobage de paraffine, ainsi que des recommandations pour les protocoles d’immunohistochimie et d’immunofluorescence sur les coupes organoïdes, et la mesure de la viabilité totale des cellules organoïdes, sont également décrites.

Introduction

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente avec un pronostic sombre d’environ 15 mois à compter du diagnostic1. Les traitements qui sont efficaces dans les études précliniques peuvent souvent être peu efficaces chez les patients 2,3. Une mauvaise réponse clinique est attribuée à de nombreux facteurs, notamment l’hétérogénéité microenvironnementale du GBM et les interactions intra-tumorales complexes. Ceux-ci peuvent être difficiles à recréer en laboratoire avec des méthodes traditionnelles d’adhésion ou de culture sphérique4. La présence d’un sous-ensemble de cellules souches cancéreuses (CSC) autorenouvelables dans le GBM peut également contribuer à cette complexité 5,6. Les CSC sont cruciaux pour la propagation tumorale et maintiennent la croissance tumorale en favorisant l’angiogenèse active, l’invasion du cancer et la résistance aux thérapies, y compris les radiations 7,8,9. Les CSC ne sont pas répartis uniformément dans les tumeurs, mais sont plutôt enrichis dans des microenvironnements spécifiques, y compris la niche périvasculaire et les régions périnécrotiques, qui fournissent chacune une régulation moléculaire distincte de leurs états cellulaires 10,11,12,13,14. Les CSC ne sont pas des destinataires passifs d’indices microenvironnementaux, mais possèdent plutôt la capacité de remodeler leurs propres microenvironnements 7,15,16. Le microenvironnement d’un SCC peut favoriser le maintien de l’état des cellules souches en réponse à des pressions telles que la rareté des nutriments, le pH et l’hypoxie17,18,19,20, ce qui suggère l’importance de ces conditions dans un système modèle. La récapitulation de la diversité du microenvironnement cellulaire au sein des tumeurs est donc essentielle pour comprendre la résistance thérapeutique et identifier de nouvelles thérapies.

La culture tridimensionnelle a gagné en popularité ces dernières années21,22. Les organoïdes ont été utilisés dans d’autres types de cancer, et l’objectif principal du maintien des cellules en tant qu’organoïdes est de permettre la croissance de populations cellulaires hétérogènes (dont beaucoup peuvent normalement être dépassées dans une culture sphérique plus homogène) et la diversité spatiale, considérée comme des microenvironnements tumoraux régionaux avec une spécificité génétique 4,23,24,25,26 . Il existe de nombreuses méthodes de culture tridimensionnelle de cellules cancéreuses, qui présentent chacune des avantages et des inconvénients27,28,29. La culture organoïde n’est pas destinée à remplacer la culture traditionnelle adhérente ou sphérique. Il est préférable de l’utiliser comme technique complémentaire aux méthodes bidimensionnelles lorsqu’il existe des questions spécifiques où l’interaction entre le microenvironnement cellulaire et les réponses des cellules tumorales est critique.

Cet article décrit des méthodes fiables et reproductibles pour générer des organoïdes GBM à partir d’échantillons primaires de patients ou de cultures dérivées de patients. Nous abordons deux objectifs différents pour la culture organoïde tridimensionnelle : (1) établir des organoïdes à partir de tissus primaires du patient, avec un potentiel de greffe maximal indépendamment de l’uniformité, ou (2) cultiver des organoïdes uniformes pour une utilisation expérimentale plus quantitative. Lors de l’établissement d’un échantillon primaire en tant qu’organoïdes, il n’est pas nécessaire de filtrer les cellules individuelles ou de compter les cellules, car il est prioritaire de conserver le nombre et les types de cellules maximaux pour établir la culture initiale. Cependant, lors de la culture d’organoïdes pour des expériences comparatives, une filtration et un comptage de cellules uniques sont nécessaires pour s’assurer que les organoïdes répliqués sont comparables pour la cohérence expérimentale. Ce protocole détaille comment établir des cultures organoïdes et créer des organoïdes uniformes, ainsi que des méthodes raffinées pour l’incorporation et la préservation des organoïdes et des expériences de culture cellulaire standard, y compris l’immunohistochimie, l’immunofluorescence et l’évaluation de la viabilité cellulaire totale dans les organoïdes GBM.

Protocol

Toutes les étapes du protocole (s) détaillé ci-dessous ont été élaborées et menées conformément au protocole #2559 du Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB) et à l’approbation #1711 du Institutional Biosafety Committee (IBC). Les sphères et les organoïdes sont cultivés dans « Neurobasal Media Complete » (NBMc). Voir le tableau 1 pour obtenir des instructions. 1. Fabrication de moules organoïdes Retirez le papier ciré de la feuille de parafilm (d’environ 4 cm x 4 cm) et placez-le entre deux plaques stériles de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à 96 puits.Effectuez ces étapes dans le capot de culture et prenez soin de garder « l’intérieur » du parafilm (le côté recouvert par le papier) propre. Ce côté propre devrait faire la concavité des indentations. Appliquez une pression uniforme sur la plaque PCR supérieure à 96 puits pour former de petites fossettes dans le parafilm. L’objectif est d’avoir des fossettes d’environ 2 mm de profondeur sans créer de trous dans le parafilm. Séparez délicatement les deux plaques PCR à 96 puits. Le parafilm alvéolé collera à la plaque supérieure. Placez-le sur de la glace sèche pendant environ 30 s. Une fois que le parafilm a été sur de la glace sèche pendant 30 s, utilisez une pince stérile pour retirer le parafilm de la plaque PCR supérieure à 96 puits.Lorsque vous retirez le parafilm, utilisez un mouvement rapide plutôt que d’être très « prudent ». Le parafilm congelé est plus facile à enlever que le parafilm chauffé, ce qui peut provoquer l’inversion des fossettes. Placez le moule parafilm terminé dans une boîte de culture cellulaire couverte et stérile de 10 cm. Les moules peuvent être fabriqués à l’avance et stockés si la stérilité est maintenue. 2. Macrodissection de l’échantillon de tissu du patient Dans une boîte de culture stérile (plaques de culture cellulaire de 10 cm), utilisez deux lames de rasoir stériles pour hacher finement l’échantillon du patient tout en appliquant une pression uniforme.REMARQUE: Il est plus facile de hacher l’échantillon avec environ 500 μL de NBMc sur le plat de culture. Essayez avec des lames de rasoir de hacher les morceaux aussi finement que possible; Idéalement, les pièces individuelles mesurent 1 mm3 ou moins. Transférer les morceaux tumoraux finement hachés dans un tube centrifuge de 15 ml à l’aide d’un embout de pipette p1000 coupé.REMARQUE: Lors de la manipulation d’organoïdes, il est important d’utiliser uniquement des pointes de pipette p1000 coupées. Ceux-ci peuvent être coupés à l’aide d’un rasoir tranchant à la taille d’ouverture souhaitée (entre 5 et 8 mm environ) et autoclavés. Ajouter 2 mL de solution de détachement de cellules à température ambiante (Table des matériaux) et placer dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant environ 10 minutes.REMARQUE: Observer et mélanger toutes les quelques minutes. Certaines solutions ou spécimens de détachement cellulaire peuvent nécessiter des temps d’incubation variables. Si l’agglutination apparaît, ce qui peut indiquer une libération d’ADN due à la lyse cellulaire, passez immédiatement à l’étape suivante. Ajouter 8 mL de milieu NBMc pour neutraliser la solution de décollement de cellule et faire tourner pendant 3 min à 65 x g. Aspirer le surnageant et remettre le tissu en suspension dans 1-2 mL de NBMc. 3. Génération d’organoïdes à partir du tissu primaire du patient REMARQUE: L’objectif lors de la fabrication d’organoïdes à partir de tissus primaires du patient est d’établir une culture tridimensionnelle. Ne filtrez pas les cellules individuelles et ne comptez pas les cellules, mais maintenez la charge initiale de la cellule aussi uniforme que possible à l’aide d’une inspection visuelle. Il est normal d’avoir une hétérogénéité dans la croissance et l’établissement des organoïdes initiaux. Chaque organoïde aura un volume de 20 μL (16 μL de matrice extracellulaire riche en laminines (lrECM) et 4 μL de tissu en suspension dans NBMc, à partir de l’étape 2.5). Les instructions peuvent être ajustées en fonction du nombre d’organoïdes prévus; L’objectif est généralement de former environ 20 à 30 organoïdes à partir d’échantillons primaires de patients. Dans un seau à glace ou un bloc froid, placez le lrECM et un petit tube à centrifuger. Placer la quantité appropriée d’ECMl (16 μL x X nombre d’organoïdes prévus) dans le petit tube à centrifuger. Ajouter le volume approprié de suspension tissulaire de l’étape 2.5 (4 μL x nombre d’organoïdes prévus) dans le tube à centrifuger sur glace. Pipeter soigneusement 20 μL du mélange lrECM/suspension cellulaire sur des moules à parafilm; Cela formera une gouttelette en forme de perle.Assurez-vous de bien mélanger le mélange lrECM/suspension cellulaire; les cellules ont tendance à s’installer facilement dans le lrECM, ce qui donne des organoïdes hétérogènes. Conserver le mélange lrECM/suspension cellulaire sur de la glace. Si lrECM se réchauffe, il peut polymériser et compromettre la formation d’organoïdes. Assurez-vous de refroidir l’embout de la pipette tous les deux ou trois organoïdes pour empêcher la polymérisation lrECM. N’introduisez pas de bulles d’air dans les organoïdes (évitez de « pousser deux fois » la pipette). Une fois que le nombre souhaité d’organoïdes est pipeté sur un moule de parafilm dans une plaque de culture cellulaire de 10 cm, couvrir avec le couvercle de la plaque et incuber dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5% CO 2 pendant1-2 h. Une fois les organoïdes solidifiés, utiliser le milieu NBMc pour les rincer doucement du moule du parafilm et les introduire dans une nouvelle plaque de culture stérile de 10 cm contenant 20 ml de NBMc au total. L’utilisation d’une pointe p1000 fonctionne mieux pour éliminer les organoïdes du moule; Ils glisseront doucement.REMARQUE: Lorsque les organoïdes sont rincés des moules dans des plaques de culture cellulaire, ils doivent être visibles dans le milieu sous forme de petites sphères roses. Si les organoïdes semblent s’être effondrés ou se sont brisés dans le milieu, cela indique un problème antérieur avec lrECM ayant polymérisé, et les organoïdes peuvent encore se développer, mais il est très peu probable qu’ils soient de taille uniforme. Placer la capsule de culture de 10 cm dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5% de CO2 (sans agiter) pendant 4 jours.REMARQUE: Placer des organoïdes sur un agitateur orbital dans les premiers jours peut les faire s’effondrer. Assurez-vous qu’ils ne tremblent pas avant le jour 4. Après 4 jours, échanger le milieu et placer sur un agitateur orbital à 80 RPM dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5% de CO2.L’échange de médias avec des organoïdes immatures est difficile car ils sont difficiles à visualiser. Incliner la capsule de culture cellulaire et attendre au moins 20 s; les organoïdes se déposeront au fond et permettront d’enlever lentement le média par le haut à l’aide d’une pipette en verre ou en plastique de 10 à 20 mL. Portez une attention particulière à la collection d’organoïdes en bas; S’ils semblent agités par la force de la suppression des médias, il est préférable de faire une pause et de leur permettre de se réinstaller. Au fur et à mesure que les organoïdes mûrissent et sont plus faciles à visualiser, ce processus devient moins nuancé.REMARQUE: Parfois, placer un morceau de papier foncé sous la plaque de culture cellulaire peut aider à visualiser les organoïdes immatures. Il est conseillé de ne pas utiliser une pipette Pasteur avec aspiration sous vide pour éliminer le fluide car il est très facile pour les organoïdes d’être aspirés et perdus de cette façon. Lorsque les organoïdes sont établis pour la première fois, ils ne consomment pas les milieux aussi rapidement que les organoïdes matures. Commencer avec 50% d’échanges de médias réduit l’utilisation inutile des médias et réduit le risque d’endommager ou d’aspirer accidentellement de nouveaux organoïdes pendant le processus d’échange de médias. 4. Génération d’organoïdes à partir d’une sphère GBM établie, d’adhérents ou d’une culture organoïde REMARQUE: L’objectif ici est de fabriquer des organoïdes de taille et de quantité de cellules uniformes pour une utilisation dans des expériences comparatives, utilisez donc un filtre à cellule unique et comptez les cellules pour vous en assurer. Préparation d’une suspension unicellulaire à partir de culture sphérique GBM.NOTE: Les cultures sphériques de cellules GBM sont conservées dans des milieux NBMc.Placer les sphères dans un tube centrifuge de 15 ml et faire tourner à 120 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et ajouter 2 mL de solution de décollement de cellules RT. Placer dans un incubateur à 37 °C pendant 3 min. Ajouter 8 mL de milieu NBMc pour neutraliser la solution de décollement cellulaire. Filtrer à travers une passoire à une seule cellule (70 μm) et faire tourner pendant 5 min à 120 x g. Retirez le surnageant du tube et remettez en suspension les cellules restantes dans ~1 mL de NBMc. Comptez les cellules (en utilisant la coloration imperméable de la cellule) et passez à l’étape 4.4. Préparation d’une suspension unicellulaire à partir d’une culture adhérente au GBM.Retirer le média usagé de la plaque, ajouter 2 mL de solution de détachement de cellules RT dans la plaque et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 3 min. Confirmez au microscope que les cellules sont détachées de la plaque. Ajouter 8 mL de milieu NBMc pour neutraliser la solution de décollement cellulaire. Filtrer à travers une crépine unicellulaire (70 μm).REMARQUE: L’effort à cellule unique est facultatif lorsque vous travaillez avec une culture adhérente. Faire tourner pendant 5 min à 120 x g. Retirez le surnageant du tube et remettez en suspension les cellules restantes dans ~1 mL de NBMc. Comptez les cellules (en utilisant la coloration imperméable de la cellule) et passez à l’étape 4.4. Préparation d’une suspension unicellulaire à partir d’une culture organoïde GBM.Transférer les organoïdes à l’aide d’une pointe de pipette p1000 coupée sur une plaque de culture de 10 cm et éliminer soigneusement autant de fluide résiduel que possible. À l’aide de deux rasoirs stériles, hacher soigneusement les organoïdes finement. Avec l’embout p1000 coupé, déplacer les organoïdes hachés dans un tube centrifuge de 15 ml et ajouter ~2-3 mL de média NBMc. Faire tourner à 120 x g pendant 3 min et retirer le surnageant (recommander d’utiliser un embout de pipette plutôt qu’une aspiration sous vide pour cette partie). Ajouter 2 mL de solution de détachement de cellules froides pendant 10 min.NOTE: La solution de détachement de cellule doit être utilisée directement à partir de 4 °C, sans être chauffée au préalable. Cela semble ramollir tout matrigel restant et aide à la récupération cellulaire. Ensuite, passez à un incubateur à 37 ° C pendant 10-20 min, en observant et en mélangeant toutes les quelques minutes. Si l’agglutination apparaît, ce qui peut indiquer une lyse cellulaire, passez immédiatement à l’étape suivante. Ajouter 8 mL de milieu NBMc pour diluer la solution de détachement cellulaire. Filtrer à travers une crépine unicellulaire (70 μm) et faire tourner pendant 5 min à 120 x g. Retirez le surnageant du tube et remettez en suspension les cellules restantes dans ~1 mL de NBMc. Comptez les cellules (en utilisant la coloration imperméable des cellules) et passez à l’étape 4.4. Fabrication d’organoïdes à partir d’une suspension unicellulaireDans un seau à glace ou un bloc froid, placez le lrECM et un petit tube à centrifuger. Placer la quantité appropriée d’ECMl (16 μL x X nombre d’organoïdes prévus) dans le petit tube à centrifuger. Créer un mélange de cellules dans un volume total (4 μL x X nombre d’organoïdes prévus) qui contiendra 20 000 cellules/organoïde et l’ajouter au petit tube centrifuge avec lrECM sur glace. Pipeter soigneusement 20 μL du mélange lrECM/suspension cellulaire sur des moules à parafilm; Cela formera une gouttelette en forme de perle.Assurez-vous de bien mélanger le mélange lrECM/suspension cellulaire, car les cellules ont tendance à se déposer facilement dans le lrECM, ce qui donnera des organoïdes hétérogènes. Conserver le mélange lrECM/suspension cellulaire sur de la glace. Si lrECM se réchauffe, il peut polymériser et compromettre la formation d’organoïdes. Assurez-vous de refroidir l’embout de la pipette tous les deux ou trois organoïdes pour empêcher la polymérisation lrECM. N’introduisez pas de bulles d’air dans les organoïdes (évitez de « pousser deux fois » l’embout de la pipette). Une fois que le nombre souhaité d’organoïdes est pipeté sur un moule de parafilm dans une plaque de culture de 10 cm, incuber à 37 °C pendant 1-2 h dans un incubateur de culture cellulaire. Une fois les organoïdes solidifiés, utiliser le milieu NBMc pour les rincer doucement du moule du parafilm et les mettre dans une nouvelle plaque de culture stérile de 10 cm contenant 20 ml de NBMc au total. L’utilisation d’une pointe p1000 fonctionne mieux pour éliminer les organoïdes du moule; Ils glisseront doucement.NOTE: Environ 15-20 organoïdes par boîte de culture de 10 cm est recommandé. Placer le plat de culture de 10 cm dans un incubateur (sans agiter) pendant 4 jours. Après 4 jours, échanger le média et placer sur un agitateur orbital à 80 RPM dans l’incubateur de culture cellulaire. Échangez des médias tous les 2-3 jours par la suite.L’échange de médias avec des organoïdes immatures est difficile car ils sont difficiles à visualiser. Incliner la capsule de culture cellulaire et attendre au moins 20 s; Les organoïdes se déposeront en bas et permettront d’enlever lentement le média par le haut avec une grande pipette en verre qui s’ouvre. Portez une attention particulière à la collection d’organoïdes en bas; S’ils semblent agités par la force de la suppression des médias, faites une pause et laissez-les se réinstaller. Au fur et à mesure que les organoïdes mûrissent et sont plus faciles à visualiser, ce processus devient moins nuancé.REMARQUE: Parfois, placer un morceau de papier foncé sous la plaque de culture cellulaire peut aider à visualiser les organoïdes immatures. N’utilisez pas de pipette Pasteur avec aspiration sous vide pour éliminer le fluide car il est très facile pour les organoïdes d’être aspirés et perdus de cette façon. Lorsque les organoïdes sont établis pour la première fois, ils ne consomment pas les milieux aussi rapidement que les organoïdes matures. Commencez par 50% d’échanges de médias pour réduire l’utilisation inutile des médias et réduire le risque d’endommager ou d’aspirer accidentellement de nouveaux organoïdes pendant le processus d’échange de médias. 5. Cryo-encastrement Placer chaque organoïde dans un tube individuel de 1,5 mL (à l’aide d’un embout p1000 coupé) contenant 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Conserver les organoïdes pendant la nuit à 4 °C. Si vous incorporez des organoïdes dans de la paraffine, passez à la rubrique 6. Après une nuit de fixation dans 4% PFA, laver les organoïdes dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) trois fois. Transférer l’organoïde dans un nouveau tube de 1,5 mL (à l’aide de l’embout coupé p1000) contenant 1 mL de saccharose à 30 % dans de l’eau et conserver à 4 °C pendant la nuit. Ajouter une petite quantité (généralement 1-2 mL) de composé à température de coupe optimale (OCT) à un cryomoule, en recouvrant le fond et en remplissant environ 1/3 à 1/2 de la profondeur du moule. Transférer un seul organoïde dans le cryomoule à l’aide de la pointe de pipette p1000 coupée. Cela entraînera le transfert de certains médias avec l’organoïde, ce qui est inévitable. Utilisez une pointe de pipette plus petite pour retirer soigneusement le milieu environnant sans déranger l’organoïde.REMARQUE: Cela peut être difficile à visualiser, mais un pipetage lent montrera une nette différence de densité entre le média et l’OCT, de sorte que cela se fait « au toucher » dans une certaine mesure). Placez le cryomoule sur un plateau de glace sèche. L’OCT commencera à geler, devenant opaque dans le processus. Ajouter un OCT supplémentaire pour couvrir complètement l’organoïde, remplissant le reste du volume du cryomoule. Les blocs peuvent être stockés à -20 °C pour un stockage à court terme pendant plusieurs jours ou à -80 °C pour un stockage à long terme indéfiniment. 6. Enrobage de paraffine Triez les organoïdes par taille (les petits organoïdes mesurent moins de 3 mm, les grands organoïdes mesurent plus de 3 mm). Transférer chaque organoïde dans une cassette histologique à l’aide d’une pointe de pipette p1000 coupée et transformer en cire de paraffine conformément au tableau 2 ou au tableau 3.REMARQUE: La taille / configuration de la cassette histologique dépend de l’utilisateur. Transférer les organoïdes des cassettes vers des moules d’encastrement avec 1 à 2 ml de cire de paraffine fondue et les refroidir jusqu’à ce que la cire soit semi-solide. Une fois que la cire est partiellement solidifiée, ajoutez plus de cire au sommet du moule. Placez le dessus de la cassette étiquetée sur le moule et transférez-le sur une plaque froide. Continuez à refroidir jusqu’à ce que la cire soit complètement solide. Lorsque la cire s’est solidifiée, sectionner le bloc à l’aide d’un microtome. Sinon, conserver à TA ou 4 °C pour une section ultérieure. 7. Immunofluorescence (FI) Déparaffiner et réhydrater les coupes de tissus de 5 à 12 μm incrustées de paraffine à l’aide d’un plat de coloration à lame, selon les étapes suivantes.REMARQUE: Si vous utilisez des sections d’organoïdes intégrés dans des OCT, nous vous recommandons d’utiliser des sections de 12 μm. Retirer l’OCT en secouant la lame dans PBS pendant 30 min. Passez à l’étape 7.2.Incuber pendant 5 min dans le xylène. Répétez cette opération deux fois de plus. Incuber ensuite pendant 10 min dans de l’éthanol à 100%. Répétez cela une fois de plus. Incuber pendant 10 min dans de l’éthanol à 95%. Répétez une fois de plus. Laver les sections à l’eau distillée pendant 5 min, deux fois. Pour le démasquage de l’antigène, immerger les lames dans 1x solution de démasquage de citrate (Table des matériaux) et micro-ondes à température inférieure à ébullition pendant 10 min. Assurez-vous de ne pas laisser la solution bouillir.REMARQUE: Ceci est mieux réalisé si vous passez d’abord au micro-ondes pendant ~ 2 minutes jusqu’à ébullition, puis diminuez la puissance et surveillez pour vous assurer que la solution ne déborde pas. La température de démasquage préférée est juste en dessous de 100 °C, idéalement 98 °C. Laisser refroidir les lames pendant 30 min à TA dans la solution de démasquage au citrate 1x.REMARQUE: Il s’agit de la même solution de citrate 1x; Il n’est pas nécessaire de remplacer la solution à cette étape. Lavez les lames à l’eau distillée pendant 5 min, deux fois. Laver les lames dans 1x tampon TBST (solution saline tamponnée Tris avec 0,1% Tween 20) pendant 5 min. Retirez les lames de TBST et séchez-les soigneusement autour des sections de tissu à l’aide d’une lingette nettoyante en laboratoire tout en prenant soin de ne pas laisser sécher la section de tissu. Une fois que la lame est suffisamment sèche, encerclez les sections de tissu avec un stylo barrière hydrophobe. Bloquer chaque section avec 100-400 μL de solution de blocage du sérum à 10% pendant 1 h à TA. Choisissez la solution de blocage du sérum en fonction de l’anticorps secondaire. Par exemple, si vous utilisez un anticorps secondaire fabriqué chez l’âne, utilisez un sérum d’âne normal à 10% dans 1x TBST. Retirer la solution bloquante, puis ajouter 100-400 μL d’anticorps primaire dilué à la concentration désirée dans la solution bloquante. À 4 °C, incuber les coupes avec l’anticorps primaire pendant une nuit. Retirer la solution d’anticorps primaire et laver les lames en 1x TBST pendant 5 min, trois fois. Ajouter 100-400 μL d’anticorps secondaire (dilution de 1:1000 dans une solution de blocage, ou selon les instructions du fabricant) à chaque section et incuber pendant 1,5 h à TA. Lavez les lames en 1x TBST pendant 5 min, deux fois. Ensuite, lavez les lames en 1x PBS pendant 5 min. Retirez les lames du PBS et séchez-les autour des sections de tissu à l’aide d’une lingette nettoyante en laboratoire. Ajouter quelques gouttes de support à durcissement liquide et monter soigneusement un couvercle en verre. Une fois les lames sèches, conserver à -20 °C à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie. 8. Immunohistochimie Dé-paraffiniser et réhydrater les sections de tissu incorporées de paraffine à l’aide d’un plat de coloration à lame, selon les étapes suivantes.REMARQUE: Si vous utilisez des sections d’organoïdes intégrés dans une OCO, retirez la TCO en secouant la lame dans PBS pendant 30 minutes. Passez à l’étape 8.2.Incuber pendant 5 min dans le xylène. Répétez deux fois de plus. Incuber pendant 10 min dans de l’éthanol à 100%. Répétez une fois de plus. Incuber pendant 10 min dans de l’éthanol à 95%. Répétez une fois de plus. Lavez les sections dans de l’eau distillée pendant 5 min, deux fois. Pour le démasquage de l’antigène, immerger les lames dans 1x solution de démasquage de citrate et micro-ondes à température inférieure à ébullition pendant 10 min. Assurez-vous de ne pas laisser la solution bouillir. Laisser refroidir les lames pendant 30 min à TA dans la solution de démasquage 1x de citrate. Lavez les lames pendant 5 min dans de l’eau distillée, trois fois. Incuber les lames pendant 10 min dans du peroxyde d’hydrogène à 3%. Lavez les lames pendant 5 min dans de l’eau distillée deux fois. Lavez les lames pendant 5 min dans 1x TBST. Retirez les lames de 1x TBST, puis utilisez le coin d’une lingette nettoyante de laboratoire pour sécher soigneusement autour des sections de tissu. Encerclez les sections de tissu avec un stylo barrière hydrophobe une fois que la lame est sèche. Placer 100 à 400 μL de la solution de blocage sur chaque section du cercle de l’enclos barrière hydrophobe à TA pendant 1 h. Utilisez 10 % de sérum d’âne normal (NDS) ou 0,75 % d’albumine sérique bovine (BSA) dilué dans 1x TBST. Ensuite, retirez la solution bloquante et ajoutez 100 à 400 μL de l’anticorps primaire à chaque section. Diluer cet anticorps primaire à la concentration désirée à l’aide du diluant approprié du fabricant. Incuber les sections à 4 °C pendant une nuit. Retirer la solution d’anticorps primaire et laver les lames en 1x TBST pendant 5 min, trois fois. Ajouter 100-400 μL de réactif de détection IHC à chaque section et incuber pendant 1 h à TA. Choisissez le réactif de détection IHC en fonction de l’anticorps primaire. Lavez chaque section avec 1x TBST pendant 5 min, deux fois, suivi de 1x PBS pendant 5 min une fois. Préparer la solution de 3,3-diaminobenzidine (DAB) conformément au mode d’emploi du fabricant. Ajouter 100-400 μL de solution DAB à chaque section de tissu et surveiller étroitement au microscope. Entre 1 et 10 minutes fourniront une intensité de coloration acceptable; Assurez-vous de noter ce temps et de rester cohérent pour toutes les sections de tissu. Une fois l’intensité de coloration souhaitée atteinte, plongez les lames dans de l’eau distillée. Effectuer une contre-coloration à l’hématoxyline et une déshydratation de la lame pour le montage conformément aux instructions du tableau 4. Retirez la lame du substitut de xylène (tableau des matériaux) et essuyez le liquide supplémentaire autour de la section de tissu à l’aide d’une lingette nettoyante en laboratoire. Utilisez une petite quantité de support de montage permanent pour fixer la glissière de couverture sur la section de tissu et laisser sécher. 9. Mesure de la viabilité totale des cellules Transférer chaque organoïde dans un tube de 2 mL et, à l’aide d’un petit embout de pipette, retirer soigneusement tout l’excès de milieu autour de l’organoïde (voir la figure 3 pour le schéma de cette procédure).NOTE: Les essais de viabilité cellulaire doivent être effectués avec des organoïdes fabriqués avec un nombre identique de cellules. Cette expérience ne doit pas être réalisée sur des organoïdes fabriqués directement à partir de spécimens de patients provenant de la chirurgie, de la coupe d’organoïdes formés alredy ou d’autres cas où des cellules individuelles n’ont pas été filtrées et comptées. Préparez le réactif de test de viabilité cellulaire luminescente et 1x PBS dans un rapport 1:1 et ajoutez 500 μL à chaque tube. Utilisez un embout de pipette p1000 pour pipeter agressivement de haut en bas pour décomposer l’organoïde et laisser reposer pendant 5 min. L’organoïde devrait être quelque peu dissocié et plus doux maintenant; Répétez le mélange avec l’embout de la pipette P1000. L’objectif est d’avoir un volume total de 100 μL par puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 25 μL du mélange de l’étape 9.3 (aura assez pour plusieurs répétitions techniques) et ajouter 75 μL de test de viabilité cellulaire luminescente restante et de mélange PBS. Placer l’assiette sur un shaker pendant 2 min puis incuber pendant 20 min à TA. Lire la plaque à l’aide d’un réglage de luminescence sur un lecteur de plaques et recueillir les données (voir Figure 4).

Representative Results

La figure 1 montre la croissance organoïde précoce observée par microscopie optique à un grossissement de 10x. La figure 1A montre la migration et l’invasion de cellules individuelles via lrECM dans la vue centrale. Les cellules continueront à se dilater et à « coloniser » le lrECM, et elles apparaîtront plus denses et éventuellement opaques par inspection visuelle. La figure 1B montre plusieurs organoïdes matures (à 7 semaines) sans grossissement, par rapport à la taille d’un centime. La figure 2 montre la coloration immunohistochimique des organoïdes GBM pour la phospho-histone H3, un marqueur de prolifération active. La plupart des cellules hautement prolifératives sont observées dans le périmètre organoïde par rapport au noyau organoïde. La coloration positive aura un aspect brun / cuivré. La figure 3 décrit le processus d’homogénéisation et de mesure du nombre total de cellules dans les organoïdes GBM à l’aide d’un test de viabilité cellulaire luminescente spécifique à la 3D. En raison du nombre élevé de cellules présentes dans les organoïdes GBM, la structure organoïde plus grande est initialement homogénéisée par trituration dans un réactif de dosage luminescent. Ensuite, des fractions du lysat organoïde total sont chargées dans des puits individuels et diluées avec un réactif de dosage luminescent supplémentaire avant l’incubation et la lecture sur un lecteur de plaques multipuits approprié. La figure 4 représente les données de contrôle DMSO (véhicule commun) pour les organoïdes. Les données tracées démontrent la cohérence intra-organoïde et inter-organoïde. Les données sur la viabilité luminescente seront généralement normalisées aux témoins de chaque échantillon lors de la production de données expérimentales. Figure 1 : Vue au microscope optique (10x). (A) Croissance organoïde précoce démontrant la migration / invasion des cellules GBM dans toute la matrice extracellulaire riche en laminine. (B) Organoïdes matures par rapport à la taille d’un centime. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Immunohistochimie des organoïdes GBM. (A, B) Organoïdes GBM présentant des cellules colorées phospho-histone H3 pour la prolifération active. Les barres d’échelle sont de 600 μm et 300 μm pour A et B, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Protocole de viabilité cellulaire luminescente pour les organoïdes. (A) Déplacer les organoïdes individuels vers de petits tubes de centrifugation et enlever l’excès de média. (B) Ajouter 500 μL de PBS 1:1 et un mélange d’essai de viabilité cellulaire luminescente à chaque tube et pipette agressivement pour décomposer l’organoïde. (C) Ajouter 25 μL de ce mélange organoïde et 75 μL du même mélange de dosage de viabilité cellulaire luminescente 1:1 et PBS à chaque puits d’une plaque de 96 puits. (D) Placer sur un agitateur pendant 2 min, suivi d’une incubation pendant 20 min à RT, puis lire la luminescence sur un lecteur de plaque. Figure réalisée à l’aide de BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Viabilité cellulaire. Données sur la viabilité cellulaire des organoïdes dans le diméthylsulfoxyde à 0,1 % (DMSO) pour six répétitions techniques de quatre organoïdes pour quatre échantillons de patients. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Composant Quantité Milieu neurobasal moins rouge de phénol 500 mL Supplément de B-27 moins vitamine A (50x) 10 mL Antibiotique-antimycotique (100x) 5 mL Pyruvate de sodium (100 mM) 5 mL Glutamine dans 0,85% NaCl (200 mM) 5 mL FGF humain recombinant basique (250 μg/mL) 20 μL Protéine EFG humaine recombinante (250 μg/mL) 20 μL Rouge de phénol 500 μL Tableau 1 : Formulation du milieu neurobasal complet (NBMc) Réactif Heure 50% d’éthanol 3 min 75% d’éthanol 3 min 95% d’éthanol 3 min 95% d’éthanol 4 min 100% éthanol 2 min 100% éthanol 3 min 100% éthanol 4 min Substitut de xylène 2 min Substitut de xylène 3 min Substitut de xylène 4 min Paraffine 15 min Paraffine 15 min Tableau 2 : Calendrier de traitement des petits organoïdes (diamètre inférieur à 3 mm) Réactif Heure 50% d’éthanol 6 min 75% d’éthanol 6 min 95% d’éthanol 5 min 95% d’éthanol 8 min 100% éthanol 5 min 100% éthanol 5 min 100% éthanol 8 min Substitut de xylène 5 min Substitut de xylène 5 min Substitut de xylène 8 min Paraffine 30 min Paraffine 30 min Tableau 3 : Calendrier de traitement des grands organoïdes (plus de 3 mm de diamètre) Réactif Heure Hématoxyline 2 min Running diH2O 2 min Réactif clarifiant l’hématoxyline nucléaire 1 min Running diH2O 1 min Réactif bleuissant 1 min Running diH2O 2 min 70% d’éthanol 1 min 100% éthanol 1 min 100% éthanol 1 min Substitut de xylène 2 min Substitut de xylène 2 min Tableau 4 : Contre-coloration de l’hématoxyline

Discussion

Les organoïdes GBM sont une méthode de culture complémentaire aux sphères traditionnelles qui incluent une plus grande hétérogénéité cellulaire et microenvironnementale 4,22,30. Bien que plus gourmande en temps et en ressources, la culture organoïde peut offrir des informations précieuses sur le comportement intra-tumoral et les mécanismes de résistance aux médicaments.

Le GBM est dirigé par une population de 5,31 SCC, et ces méthodes ont été élaborées pour permettre la croissance continue et l’auto-renouvellement de cette population de SCC. Le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) sont connus pour améliorer le maintien et la croissance des cellules souches et fournir une signalisation active du récepteur tyrosine kinase (RTK). La formation de populations cellulaires hétérogènes et de microenvironnements tumoraux distincts au sein des tumeurs GBM repose sur le soutien des comportements CSC. La sélection d’un lrECM imite l’environnement cérébral riche en laminine et aide les cellules en culture organoïde à s’auto-organiser et à migrer par invasion. Bien que certains groupes aient établi une culture organoïde sans utiliser de lrECM ou de milieu enrichi en EGF/FGF24,28, ce qui peut offrir une méthode de culture plus rapide et une sélection plus forte de la signalisation oncogénique pour stimuler la croissance, ces méthodes ont été choisies pour optimiser l’environnement des cellules souches afin d’établir au mieux l’hétérogénéité cellulaire des organoïdes. Les organoïdes cérébraux et les organoïdes GBM ont été fabriqués avec lrECM dans la littérature précédemment 21,32,33. Bien que nous ayons établi des données concernant les populations tumorales trouvées dans les organoïdes et la variation spatiale, on en sait moins sur les populations non tumorales au sein des organoïdes et combien de temps elles survivent à partir des échantillons originaux des patients. Certaines colorations IHC (telles que CD45) peuvent fournir ces données et pourraient constituer un point de recherche intéressant à l’avenir avec les organoïdes.

Il est important de connaître l’utilisation prévue de la culture organoïde pour choisir les méthodes appropriées. L’établissement d’organoïdes à partir de spécimens primaires par rapport à la culture d’organoïdes uniformes pour des expériences spécifiques a des procédures légèrement différentes. Avoir une appréciation de la façon dont les organoïdes mûrissent et remplissent visuellement l’échafaudage lrECM est important pour pouvoir allouer le temps et les ressources nécessaires à la culture organoïde. Les régions clairsemées de cellules dans les organoïdes se dilatent lentement et se développent pour remplir le lrECM, ce qui peut prendre de 2 à 8 semaines, selon le comportement du spécimen. Ce taux de croissance est quelque peu intrinsèque à chaque spécimen; Il est conservé à travers différents lots d’organoïdes et assez cohérent avec le taux relatif de croissance des sphères. Les organoïdes peuvent être maintenus pendant plus de 1 an et conservent les capacités de formation de tumeurs sur xénogreffe chez la souris; Cependant, il est recommandé de les cultiver dans un but distinct afin de ne pas gaspiller les ressources du laboratoire (à la fois le matériel et le temps)4. La croissance organoïde a été testée dans plusieurs tailles et formats de puits, et montre qu’une plaque de 10 cm est le cadre idéal pour maintenir une viabilité cellulaire optimale, suivie d’une plaque de 6 puits avec trois organoïdes par puits34. Les organoïdes consomment plus de milieux que leurs homologues de culture bidimensionnelle, et l’utilisation d’un format de puits plus petit ne conduit pas à un entretien approprié. Par exemple, un puits d’une plaque de format 96 puits n’a pas assez d’espace ou de volume de média par rapport à la taille d’un organoïde pour soutenir la croissance organoïde.

Comme les organoïdes l’établissent, être observateur est important pour augmenter le succès. Initialement, les organoïdes consommeront des milieux lentement, mais à mesure qu’ils deviendront plus denses et plus matures, ils consommeront des milieux plus rapidement. L’ajout de rouge de phénol au milieu peut aider à servir d’indicateur de la consommation des médias. Lorsque le milieu est plus jaune, cela peut nous inciter à ajuster le schéma d’alimentation, que ce soit pour échanger un volume plus élevé de milieu, augmenter la quantité totale de milieux dans la plaque, diviser les organoïdes entre plusieurs plaques de culture cellulaire pour suivre leur croissance, ou même ajuster le calendrier des expériences.

À bien des égards, les organoïdes sont un moyen inefficace de mener des recherches sur le cancer. Ils impliquent de longues échelles de temps, et sont coûteux et riches en ressources par rapport à la culture de sphère GBM. Cependant, comparées aux xénogreffes dérivées de patients, une méthode alternative pour recréer la diversité cellulaire et microenvironnementale, elles sont plus simples, moins coûteuses et contrôlables. Le choix du meilleur moment d’utiliser les organoïdes est important pour les chercheurs sur le cancer. Ils ne sont pas destinés à remplacer la culture traditionnelle de sphère ou d’adhérent et non à remplacer les modèles de xénogreffes. Les organoïdes peuvent, lorsqu’ils sont appliqués à la bonne question scientifique, combiner les avantages de ces deux systèmes et peuvent nous permettre d’observer la biologie des cellules tumorales qui resterait autrement cachée. La communauté scientifique commence seulement à comprendre les possibilités d’apprentissage offertes par les organoïdes, mais il est clair qu’ils seront un outil inestimable à l’avenir pour comprendre la biologie complexe du GBM.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le Dr Justin Lathia pour ses précieux conseils et son soutien continu. Nous remercions également Katrina Fife, Lisa Wallace et Maya Camhi pour leur excellent soutien technique.

Materials

3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets MP Biomedicals 08980681 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets
96-well PCR plates ThermoFisher Scientific 96-well PCR plates
Accutase ThermoFisher Scientific SCR005 Cell detachment solution
Antibiotic-antimycotic ThermoFisher Scientific 15240062 Antibiotic-antimycotic
B-27 supplement minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587001 B-27 supplement minus vitamin A (50x)
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24590 Bluing reagent
Cell strainer (70 µm) CellTreat Scientific 229483 Cell strainer (70 µm)
CellTiter-Glo 3D Promega G9681 Luminescent cell viability assay
Clarifier 2 ThermoFisher Scientific 7301 Nuclear hematoxylin clarifying reagent
Clear-Rite 3 ThermoFisher Scientific 6901 xylene substitute
Epredia Gill 2 Hematoxylin ThermoFisher Scientific 72504 Hematoxylin
Glutamine in 0.85% NaCl ThermoFisher Scientific 35050061 Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM)
Matrigel ThermoFisher Scientific 354234 Laminin-enriched extracellular matrix
Mini PAP pen ThermoFisher Scientific 008877 Hydrophobic barrier pen
Mounting medium ThermoFisher Scientific 22-050-102 Mounting medium
Neurobasal media minus phenol red ThermoFisher Scientific 12349015 Neurobasal media minus phenol red (500 mL)
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 Normal donkey serum (NDS)
Paraformaldehyde 4% in PBS ThermoFisher Scientific AAJ19943K2 Paraformaldehyde 4% in PBS
Phenol red Sigma P0290 Phenol red (0.5%)
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P10144 Liquid curing mountant
Recombinant human EGF protein R&D systems 236-EG-01M Recombinant human EGF protein (250 µg/mL)
Recombinant human FGF basic R&D systems 4144-TC-01 Recombinant human FGF basic (250 µg/mL)
SignalStain Antibody Diluent Cell Signaling 8112 Antibody diluent
SignalStain Boost IHC Detection Reagent Cell Signaling 8114 Immunohistochemistry detection reagent
SignalStain Citrate Unmasking Solution Cell Signaling 14746 Citrate unmasking solution
Single edge razor blade Uline H-595B Single edge razor blade
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific 11360070 Sodium pyruvate (100 mM)
Tissue-Tek Cryomolds VWR 25608-916 Disposable cryomolds
Tissue-Tek O.C.T. Compound VWR 25608-930 Optimal cutting temperature compound
Trypan Blue Stain ThermoFisher Scientific T10282 Cell impermeant stain (0.4%)
Xylene ThermoFisher Scientific X3P-1GAL Xylene
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Sundar, S. J., Shakya, S., Recinos, V., Hubert, C. G. Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture. J. Vis. Exp. (186), e63745, doi:10.3791/63745 (2022).
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