설치류 조직의 산탄총 지질체

다발성 경화증의 발전으로 많은 지질 종을 정확하게 모니터링하는 다양한 방법이 나왔지만 다양한 포유류 조직의 이전 지질 프로파일링은 일관된 결과를 나타내지 않았으며 결과적으로 지질의 특정 조직 특이적 기능은 불분명합니다. 특정 화합물의 발현을 녹아웃하기 위한 보다 강력한 접근법을 사용할 수 있는 단백질 기능 분석과 비교할 때, 대부분의 지질은 조직에서 선택적으로 꺼지거나 과발현될 수 없으므로 지질의 기능 평가가 어렵습니다. 조직 지질체 농도의 고급 프로파일링은 순환 지질과 인간 질병 사이의 연관성을 식별하기 위한 대안적 접근법을 제공할 수 있습니다.

모든 마우스 조직의 내인성 지질 프로파일을 정성적 및 정량적으로 커버할 수 있는 포괄적인 지질체학 방법을 평가할 때 우리는 산탄총 지질체학 방법을 선호했습니다. 일반적으로 두 가지 상반된 유형의 시료 분석이 가능합니다: 액체 크로마토그래피(LC) 기반 분리를 사용한 지질의 완전 비표적 스크리닝과 시료의 전체 지질 복잡성을 밝히기 위한 추가 질량 분석 검출 또는 관심 있는 특정 지질의 매우 정밀한 정량화를 가능하게 하는 표적 접근법. 대조적으로, 제시된 샷건 지질체학 워크플로우의 강력한 특징은 사전 정의된 지질 클래스의 수백 가지 내인성 지질에 대한 신속하고 포괄적인 커버리지이며, 이는 여전히 강력한 반정량적 방식으로 수행될 수 있습니다.

상이한 지질 부류의 이온화 효율은 구조에 따라 다르며 상이한 실험 이온화 조건에 따라 크게 달라질 수 있다. LC 기반 분리 분석법과 달리, 샷건 분석은 동일한 이온화 조건에서 전체 지질 추출물을 MS 기기에 직접 동시에 주입하기 때문에 이러한 차이를 최소화합니다. 동위원소로 표지된 지질 유사체 또는 구조적으로 유사한 비내인성 표준물질의 사용은 모든 지질 부류의 반정량화를 가능하게 한다. Shotgun 지질체학은 MS 분석 중에 낮은 실행 간 및 실행 중 변동성을 제공합니다. 결과적으로, 이 분석법은 적절한 정량화를 위해 여러 표준물질이 필요한 비표적 액체 크로마토그래피 기반 분석법보다 낮은 변동 계수²¹ 을 생성합니다. 중요하게도, 현재의 방법에서는 외부 검량선이 사용되지 않지만, 이 방법은 여전히 완전한 정량적³²로 간주된다.

지질 부류당 표지된 내부 표준물질(또는 내인성적으로 발현되지 않는 표지되지 않은 표준물질)의 한 수준은 대부분의 지질의 정량화에 충분하다. 소수의 출판물만이 산탄총 지질체학 분석법에 대한 부분 분석법 검증을 보고했습니다. 예를 들어, Gryzbek et ^al.17 및 Surma et ^al.21에서 내부 표준물질과 고정된 양의 샘플 매트릭스를 사용하여 역보정 곡선을 준비했습니다. 선형성은 로그-변환된 지질의 양과 그 강도의 선형 회귀에 의해 평가되었고, 각각 R2 및 기울기로 보고되었다. 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ)는 LOD의 경우 신호 대 잡음비 3, LOQ의 경우 10을 기반으로 한 가중 선형 회귀에 의해 결정되었습니다. 대부분의 지질 부류의 경우, LOQ는 지방 조직의 경우 2-9.8 pmol, 혈장의 경우 0.05-5μM 사이에서 정의되었습니다. 두 경우 모두, 클래스 당 비내인성 단일 내부 표준물질을 사용하여 클래스 내의 모든 지질에 대한 추정치를 도출했습니다. 그러나, 이 연구에서, 우리는 몇 가지 우려 때문에 LOD/LOQ를 제공하지 않습니다: 내인성 매트릭스는 화합물이 없고, 조직에 대한 대리 매트릭스는 사용할 수 없습니다 – 이로 인해, 알려진 소량의 표준물질의 스파이크가 불가능합니다. 우리는 순수 표준물질의 존재가 없고 동위원소 표지된 지질의 가용성이 매우 제한되어 있기 때문에 동일한 동위원소 표지 표준물질로 정규화된 특정 화합물의 검량선 시리즈를 사용하여 고전적인 표적 정량화 접근법을 수행하지 않습니다. Orbitrap 검출기는 푸리에 변환을 적용하여 과도 신호의 변환을 자동으로 수행하며, 일부 신호는 이미 대체되어 있으며, 그 결과 낮은 농도 범위는 최소 신호까지만 선형이 되어 그 이하에서는 분자를 더 이상 검출할 수 없습니다. Xcalibur 소프트웨어 신호 대 잡음 값은 분자의 m/z 비율에 따라 달라집니다. 결과적으로, 지방산의 상이한 조합을 함유하는 각 지질 부류의 화합물은 상이한 잡음 값을 가질 것이다. 또한, LOQ/LOQ 값은 매트릭스 유형과 엄격하게 연관되어 있으며, 다른 설치류 조직에서 지질체의 정량화를 수행할 때 각 조직 유형에 대한 LOQ를 개별적으로 평가하여 반영해야 합니다.

실제로, 이 방법은 최대 4자릿수(³³)의 높은 선형 동적 정량화 범위와 가장 중요한 내인성 구조적 지질을 커버하는 매우 우수한 감도를 제공하며, 이는 MS 획득⁽³²)의 기술적 개선에 의해 추가로 증가될 수 있다. 평균 지질 농도의 변동 계수는 대부분 15% 미만이었는데, 이는 산탄총 지질체학이 GLP(Good Laboratory Practice) 및 GCLP(Good Clinical Practice) 연구에서 고려해야 할 방법으로 FDA(Food and Drug Administration) 요구 사항을 준수함을 의미합니다³⁴.

그러나 극성이 다르기 때문에 일부 지질 클래스는 특정 공액 FA의 기여에 의해 훨씬 더 많은 영향을 받는다는 점에 유의해야 합니다. 이로 인해 광범위한 공액 FA를 포함하는 등몰 혼합물에서 강도 반응이 왜곡되어 인지질 부류에 대해 Koivusalo et ^al.35 에서 강조한 바와 같이 정량화 편향이 발생합니다. 참고로, 이 저자들은 24-48 사슬 길이의 광범위한 FA에 대한 데이터를 제시했는데, 이는 실제 생물학적 샘플의 상황을 반영하지 않을 가능성이 높습니다. 고도불포화 종에 대한 반응은 완전 포화 종보다 40% 더 높았지만, 이 효과는 더 높은 농도에서만 관찰되었습니다. 혼합물이 점진적으로 희석되었을 때, 불포화의 효과는 점차 감소하고 종당 0.1 pmol/μL에서 사실상 사라졌습니다. 또한 모든 측정은 Q-Exactive 장비가 아닌 이온 트랩 및 삼중 사중극자 장비에서 수행되었습니다.

제시된 워크플로의 또 다른 장점은 특정 프로젝트 요구 사항에 적응할 수 있는 기술적 유연성입니다. 예를 들어, 임의의 지질 추출 프로토콜 – 예컨대 변형된 Bligh and Dyer³⁶, 메틸 tert-부틸 에테르 37, 또는 부탄올-메탄올³⁸ – MS 분석 전에 총 지질 추출물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 클로로포름-메탄올 추출의 주요 한계는 하부 상에 지질 분획이 포함되어 있어 일상적인 작업, 특히 자동화를 복잡하게 만든다는 것입니다. 또한 클로로포름의 독성을 고려해야합니다. tert-부틸 에테르 추출은 혈장 샘플의 지질 분석에 널리 사용된다⁽³⁷), 자동화된 버전이 제안되었다⁽²¹). 이 경우, 우리는 스파이크된 PG, PI, PA 및 PS 지질 클래스³⁸에 대해 훨씬 더 나은 회수율, 더 낮은 용매 소비 및 자동화^가능성(39)을 제공하는 반면, 세 가지 방법 모두에 의해 추출된 조직 샘플에 대해 정량화된 전체 농도가 비슷하기 때문에 BUME 방법을 선택했습니다. 또한 현재 작업에서는 샘플 추출을 수동으로 수행했지만 96웰 형식^40,41에서 자동화된 샘플 준비 및 지질 추출을 통해 대규모 샘플 세트에서 재현 가능하고 정확한 결과를 얻을 수도 있습니다. 이를 통해 대규모 임상 및 독성학 연구에서 지질학 분석을 구현할 수 있습니다.

현재 작업에서 우리는 Schuhmann et ^al.42에 의해 설명된 바와 같이 극성 전환 없이 별도로 양극 및 음극 모드의 MS 획득을 수행했습니다. 나노메이트 신호의 안정성은 포지티브 모드에서보다 약간 덜 농축된 용액에 대해 네거티브 모드에서 더 좋습니다. 또한 .raw 파일에서 mzML로 변환하는 컨버터 소프트웨어를 사용하여 LipidXplorer 소프트웨어에서 지정할 값을 제공하는 완전히 추적 가능한 절차를 개발했으며, 이를 통해 수동 분해능 기울기 계산이 필요하지 않습니다. 우리는 또한 다른 노이즈 설정 대체를 적용했는데, 이는 포지티브 모드에서, 스펙트럼의 노이즈 레벨이 네거티브 모드에서보다 높기 때문이다. 모든 단계는 추적 가능하고 처리량이 많은 일상적인 분석에 최적화되었습니다.

식별을 위해 산탄총 지질체학 분석은 서로 다른 극성 모드에서 고유한 부가물을 형성하는 서로 다른 지질 클래스의 고유한 거동을 활용할 수 있습니다. 이 방법에서, 양의 이온화 모드에서 겹치는 동일한 분자량을 갖는 PC 및 PE 종은 PC가 아세테이트 또는 포름산염 부가물을 형성하고 PE가 탈양성자화된 형태로 이온화됨에 따라 음의 이온화 모드에서 완전히 분리될 수 있습니다. 또한, (부분적) 구조적 디콘볼루션(deconvolution)은 분자식뿐만 아니라 벌크 지방산 구조를 활용하는 방법에 대해서도 가능하다. 예를 들어, 총 탄소 및 총 불포화 계수 수준에 대한 FA 식별은 모든 인지질, DAG, TAG 및 리소-인지질에 대해 작동합니다. 각각의 이성질체 형태의 상향식 정량화는 인지질 부류⁽⁴³ )의 일부에 대해 부분적으로 수행될 수 있지만, MS2 스펙트럼에서 상이한 FA의 불균등한 신호 응답으로 인해 DAG 및 TAG에 대해 훨씬 더 복잡하다.

또한 이 분야의 최근 이니셔티브와 완전히 일치하는 적절한 품질 관리 절차를 구현할 필요성을 강조하는 것도 중요합니다⁴⁴. 실험실 간 및 실험실 내에서 적절한 데이터 추적성 및 재현성을 보장하기 위해 분석의 모든 단계에 대한 샘플의 적절한 무작위화, 공급업체 인증 표준 혼합물 사용, 품질 관리 샘플 포함, 배치 승인 또는 거부 확인 절차, 장기적으로 QC 성능을 추적하기 위한 내부 데이터베이스 생성과 같은 여러 단계가 수행되었습니다. 또한 이러한 이니셔티브와 일관되게 시료 안정성을 해결하기 위한 표준화된 분석법이 필요합니다. 일반적으로 대부분의 구조적 지질은 지질 산화의 영향을 받지 않으며, 이는 산화리핀, 산화된 지질 및 고도불포화 지방산과 더 관련이 있으므로 보관 및 취급 조건에 훨씬 더 민감합니다. 그러나 시료 안정성에 대한 정확한 평가는 여전히 기술적으로 어려운 작업입니다.

그러나 이 프로토콜은 화합물의 아분자 수준을 결정할 때 한계가 있습니다. 전체 추출물의 분리가 없다는 것을 고려하여, 동일한 분자량을 갖지만 상이한 지방산 조성을 갖는 지질의 모든 이소형이 MS 분석에서 병합된다. 대부분의 클래스의 경우 MS2에서 잔류 지방산 단편의 단편화 비율을 사용하여 구조의 부분 디콘볼루션을 달성할 수 있습니다. 그러나 각 동형체의 독립적인 정량화는 서로 다른 동형체의 단편화 거동의 큰 차이와 순수한 화학 표준물이 보상 값을 정의할 만큼 충분히 다양하지 않다는 사실 때문에 특히 어려운 작업으로 남아 있습니다. 또 다른 한계는 ESI 공정이 필연적으로 아티팩트를 생성하여 DAG, Pas 및 FA와 같은 일부 지질에 대한 피크를 인위적으로 생성하여 잘못된 정량화로 이어질 수 있다는 것입니다.

다음으로, 우리는 우리의 경험을 바탕으로 프로토콜의 가장 중요한 부분을 요약합니다. 첫 번째는 각 마우스 조직 유형이 지질량과 클래스 비율 측면에서 고유한 지질 프로필을 갖는다는 사실과 관련이 있습니다. 이를 통해, 추출 전의 총 단백질 함량을 기준으로 한 조직의 출발량은 MS 신호를 포화시키지 않고 고농도³³ 에서 지질 응집으로 인한 동적 정량 범위를 벗어나지 않도록 주의 깊게 결정되어야 하며, 또는 반대 극단에서 각 지질 부류에 대한 주요 지질 화합물을 커버하기에 충분한 MS 신호를 제공해야 합니다.

두 번째 중요한 측면은 직접 주입 나노소스 칩 출구의 위치와 질량 분석기의 전달 모세관의 적절한 정렬을 보장하는 것입니다. 두 모드에서 질량 분석기의 전체 보정이 매주 수행된다는 점을 고려할 때, 보정 소스와 나노 소스 칩 설정 간의 교체는 설치 중 정렬 불량으로 인한 신호 강도의 급격한 변동의 원인이 될 수 있습니다.

프로토콜의 또 다른 중요한 부분은 내부 표준 믹스를 신중하게 처리하는 것입니다. 이 혼합물에는 상당한 양의 디클로로메탄이 포함되어 있으므로 일단 개봉하면 증발 및 인공 농도 변화로 이어지는 장기 보관 및 다중 사용을 피하기 위해 신속하게 섭취해야 합니다. 또한, -20°C 보관에서 제거한 후 표준 혼합물을 일관되게 취급하는 것이 중요한데, 이는 온도 차이로 인해 에어쿠션 피펫으로 피펫팅하는 동안 부피 불일치가 발생할 수 있기 때문입니다. 옵션은 표준 재현탁 완충액의 디클로로메탄을 순수한 메탄올로 대체하는 것인데, 이는 취급 편의성을 향상시킬 수 있지만 일부 지질 클래스의 용해도에 부정적인 영향을 미쳐 이러한 지질 클래스의 정량 정확도를 감소시킬 수 있습니다.

마지막으로 중요한 부분은 데이터 처리입니다. 데이터 처리 워크플로는 .raw에서 .mzML 형식으로의 Peak by Peak 소프트웨어 변환을 결합하여 MS2 스캔 평균화, MS1 및 MS2 노이즈 필터링, 피크 피킹 및 데이터 압축을 적용합니다. 대안으로 Proteowizard 소프트웨어를 데이터 변환에도 사용할 수 있지만 이 경우 LipidXplorer의 여러 설정을 수동으로 정의해야 합니다. 샷건 지질체학의 모든 복잡성은 특히 직접 주입 MS1 및 MS2 스펙트럼의 디콘볼루션 단계에 집중되어 있습니다. 오픈 소스 LipidXplorer 소프트웨어는 질량 정확도, 질량 분해능 및 m/z 증가에 따른 변화 기울기를 기반으로 mzML 파일 형식에서 변환된 스펙트럼을 가져옵니다. 이 소프트웨어는 분석 실행 내에서 획득한 여러 개별 MS 및 MS/MS 스펙트럼을 병합합니다. 그런 다음 서로 다른 샘플 실행 내에서 개별 피크를 정렬하고, 정렬된 피크의 각 클러스터에서 해당 질량을 단일 강도 가중 평균 질량으로 대체하고 각 데이터 파일의 풍부도는 그대로 유지합니다. 정렬된 피크 클러스터의 대표 질량과 개별 피크 강도는 마스터 스캔 데이터베이스에 저장됩니다. 마스터 스캔 데이터베이스에는 배치의 모든 샘플에 대해 생성된 모든 MS1 및 MS2 스펙트럼이 포함되어 있으며 MFQL(Molecular Fragmentation Query Language)로 작성된 쿼리를 통해 지질 식별로 디콘볼루션할 수 있습니다.

전반적으로, 이 방법은 양성 모드를 기반으로 하는 DAG, TAG 및 SE 지질과 음성 모드 획득을 기반으로 하는 PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC 및 LPE 지질의 식별을 다룹니다. 지질 식별 중에 MS1 및 MS2에 대해 동위원소 보정이 수행되고 조정된 강도가 .xlsx 출력 파일에 보고됩니다. 또는 ALEX⁴⁵ 및 LipidHunter⁴⁶과 같은 여러 다른 소프트웨어를 사용하여 샷건 데이터를 처리할 수 있습니다.

주요 핵세포 및 세포막 구성 요소인 지방산은 생리 활성 분자로의 추가 전환을 위해 인지질 형태로 저장됩니다. 이들은 리소인지질 아실트랜스퍼라제 효소에 의해 Lands 경로⁴⁷을 통해 리소인지질로 전환될 수 있습니다. 예를 들어, LPCAT3 효소는 AA를 리소포스파티딜콜린 및 리소포스파티딜세린 중간체에 통합하기 위해 높은 특이성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 효소의 상대적으로 높은 발현은 폐포 대식세포 및 기관지 상피 세포와 같은 염증 세포 내에서 보고되었으며,⁴⁷, 이는 해당 세포에서 AA 함유 인지질의 상대적 비율이 더 많이 방출되도록 합니다. 그러나, 포스포리파아제 A2에 의해 막 인지질로부터 이들이 유리된 후, PUFA를 다양한 유형의 지질 매개체로 전환시키는 것은 많은 효소에 의해 촉매된다⁴⁸. 또한, 이들 PUFA는 사이클로옥시게나제(COX)-1 및 COX-2 효소⁴⁷의 작용을 통해 전염증성 및 항염증성 프로스타글란딘의 생산을 위한 기질이 될 수 있다. 인지질은 생물학적 효과를 입증하기 위해 이러한 매개체가 필요한 특정 위치에서 방출되는 지질 매개체의 공급원 중 하나입니다.

폐는 여러 세포 유형으로 구성된 복잡한 기관으로, 각 세포는 정상적인 폐 발달과 기능을 촉진하는 데 겹치고 틈새 역할을 합니다. 마우스 또는 인간 폐에서 다양한 세포 유형(예: 폐포 유형 2 세포)을 분리하고 프로파일링하기 위한 연구는 소수에 불과합니다^.49,50; 다른 주요 폐 세포 유형은 특성화되지 않았습니다. 또 다른 흥미로운 연구⁵¹은 마우스 폐에서 내피, 상피, 중간엽 및 혼합 면역 세포의 지질 분석을 분리하고 수행하기 위해 수행되었습니다. PCO 및 PG에 혼입된 PUFAs의 농도가 면역 세포에서 농축되는 것이 관찰되었다. 기관지폐포 세척(BAL)⁵²에 의해 평가된 바와 같이 CS가 폐 내 면역 세포의 증가(4-5배)를 유도한다는 사실을 고려할 때, 이 연구에서 관찰된 총 지질 변화는 마우스 폐에서 면역 세포 모집의 누적 증가로 설명될 수 있습니다.

결론적으로, 인지질에 포함된 단일불포화 지방산 및 PUFA의 관찰된 왜곡은 세포 내 특정 FA의 과잉을 반영하거나 산화 스트레스 및 염증 조건에서 과잉 생산되는 옥시리핀 전구체의 세포 내 자원을 구성할 수 있습니다. 그러나 유리 EPA, DHA 및 기타 옥시리핀에 대한 추가 데이터는 이 점을 명확히 하는 데 필수적이며 현재 방법 적용 범위를 벗어납니다.