Shotgun Lipidômica de Tecidos de Roedores

Embora os avanços na SM tenham gerado uma variedade de métodos para monitorar com precisão muitas espécies lipídicas, o perfil lipídico prévio de vários tecidos de mamíferos não mostrou resultados consistentes e, consequentemente, as funções específicas dos lipídios permanecem obscuras. Em comparação com a análise funcional de proteínas, para a qual estão disponíveis abordagens mais robustas para nocautear a expressão de determinados compostos, a maioria dos lipídios não pode ser seletivamente desligada ou superexpressa nos tecidos, dificultando a avaliação funcional dos lipídios. O perfil avançado das concentrações de lipidoma tecidual pode fornecer uma abordagem alternativa para identificar associações entre lipídios circulantes e doenças humanas.

Na avaliação de métodos lipidômicos abrangentes capazes de cobrir qualitativa e quantitativamente o perfil lipídico endógeno de qualquer tecido de camundongo, demos preferência ao método lipidômico shotgun. Em geral, dois tipos opostos de análise de amostra são possíveis: ou uma triagem completamente não direcionada de lipídios usando separação baseada em cromatografia líquida (LC) com detecção espectrométrica de massa adicional para revelar a complexidade lipídica total da amostra, ou abordagens direcionadas, que permitem principalmente a quantificação muito precisa de lipídios específicos de interesse. Em contraste, a forte característica do fluxo de trabalho lipidômico apresentado é a rápida cobertura abrangente de centenas de lipídios endógenos de classes lipídicas predefinidas, que ainda podem ser realizadas de forma semiquantitativa robusta.

As eficiências de ionização de diferentes classes lipídicas são estrutura-dependentes e podem variar drasticamente dependendo das diferentes condições experimentais de ionização. Em contraste com os métodos de separação baseados em LC, a análise shotgun minimiza essas diferenças devido à infusão simultânea direta do extrato lipídico inteiro sob as mesmas condições de ionização no instrumento MS. O uso de análogos lipídicos isotopicamente marcados ou padrões não endógenos estruturalmente semelhantes permite a semi-quantificação de todas as classes lipídicas. A lipidômica shotgun fornece baixa variabilidade inter e intra-corrida durante a análise da SM; Como resultado, esse método produz coeficientes de variação²¹ mais baixos do que os métodos baseados em cromatografia líquida não direcionada, que requerem múltiplos padrões para quantificação adequada. É importante ressaltar que, embora nenhuma curva de calibração externa seja utilizada no método atual, o método ainda é considerado totalmente quantitativo³².

Um nível de padrão interno marcado (ou padrão não rotulado que não é expresso endogenamente) por classe lipídica é suficiente para a quantificação da maioria dos lipídios. Poucas publicações relataram a validação parcial do método lipidômico shotgun. Por exemplo, em Gryzbek et ^al.17 e Surma et ^al.21, curvas de calibração inversas foram preparadas usando padrões internos e uma quantidade fixa de matriz amostral. A linearidade foi avaliada pela regressão linear dos teores de lipídios log-transformados e suas intensidades e relatada como R² e inclinação, respectivamente. O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) foram determinados por regressão linear ponderada baseada em uma relação sinal-ruído de 3 para LOD e 10 para LOQ. Para a maioria das classes lipídicas, o LOQ foi definido entre 2-9,8 pmol para o tecido adiposo e 0,05-5μM no plasma. Em ambos os casos, padrões internos únicos não endógenos por classe foram usados para derivar estimativas para todos os lipídios da classe. No entanto, neste trabalho, não fornecemos LOD/LOQ devido a várias preocupações: a matriz endógena não é livre de compostos e a matriz substituta para tecidos não está disponível – com isso, a espícula de pequenas quantidades conhecidas de padrões não é possível. Nós não realizamos uma abordagem clássica de quantificação direcionada com o uso de uma série de curvas de calibração de um determinado composto normalizado por seu padrão isotopicamente marcado idêntico devido à inexistência de padrões puros e à disponibilidade muito limitada de lipídios marcados isotopicamente. Os detectores Orbitrap realizam automaticamente a conversão do sinal transiente aplicando uma transformação de Fourier, e algum sinal já é substituído – como resultado, a faixa de concentração mais baixa será apenas linear até algum sinal mínimo, abaixo do qual a molécula não será mais detectável. Os valores sinal-ruído do software Xcalibur dependem da relação m/z da molécula; Como resultado, os compostos de cada classe lipídica, contendo diferentes combinações de ácidos graxos, terão diferentes valores de ruído. Além disso, os valores de LOQ/LOQ estão estritamente ligados ao tipo de matriz, e quando a quantificação do lipidoma é feita em diferentes tecidos de roedores, isso deve ser refletido pela avaliação de LOQs para cada tipo de tecido individualmente.

De fato, o método oferece uma alta faixa de quantificação dinâmica linear de até quatro ordens de magnitude³³ e sensibilidade muito boa para cobrir os lipídios estruturais endógenos mais importantes, que podem ser aumentadas por melhorias técnicas na aquisição de MS³². Os coeficientes de variação das concentrações médias de lipídios foram, em sua maioria, inferiores a 15%, o que significa que a lipidômica shotgun atende aos requisitos da Food and Drug Administration (FDA) como método a ser considerado para estudos de boas práticas de laboratório (BPL) e boas práticas clínicas (BPL)³⁴.

No entanto, deve-se notar que, devido à sua polaridade diferente, algumas classes lipídicas tornam-se muito mais impactadas pela contribuição de AGs conjugados específicos. Isso leva à distorção na resposta de intensidade em misturas equimolares contendo uma ampla gama de AGs conjugados, resultando em viés de quantificação, como destacado por Koivusalo et ^al.35 para classes de fosfolipídios. Vale ressaltar que esses autores apresentaram dados para uma ampla gama de AGs, de 24 a 48 cadeias de comprimento, o que provavelmente não reflete a situação em uma amostra biológica real. A resposta para as espécies poli-insaturadas foi 40% maior do que para as espécies totalmente saturadas, mas esse efeito só foi observado para concentrações mais elevadas. Quando a mistura foi progressivamente diluída, o efeito da insaturação diminuiu gradualmente e praticamente desapareceu a 0,1 pmol/μL por espécie. Além disso, todas as medidas foram realizadas em instrumentos armadilha de íons e triplos quadrupolos e não em equipamentos Q-Exactive.

Outra vantagem do fluxo de trabalho apresentado é a sua flexibilidade técnica, que permite a adaptação aos requisitos específicos do projeto. Por exemplo, qualquer protocolo de extração lipídica – como os métodos Bligh e Dyer 36 modificados, éter metil terc-butílico³⁷ ou butanol-metanol³⁸ – pode ser usado para preparar um extrato lipídico total antes da análise de EM. A principal limitação da extração clorofórmio-metanol é que a fase inferior contém a fração lipídica, o que dificulta o trabalho rotineiro e, principalmente, a automação; Além disso, a toxicidade do clorofórmio deve ser considerada. A extração com éter terc-butílico é amplamente utilizada para análise lipídica de amostras de plasma³⁷, e uma versão automatizada tem sido proposta²¹. Neste caso, optou-se pelo método BUME por proporcionar recuperações ainda melhores para as classes lipídicas PG, PI, PA e PS fortificadas³⁸, menor consumo de solvente e possibilidade de automação³⁹, enquanto as concentrações totais quantificadas para amostras de tecido extraídas pelos três métodos foram comparáveis. Além disso, embora a extração da amostra tenha sido realizada manualmente no presente trabalho, também é possível obter resultados reprodutíveis e precisos a partir de grandes conjuntos de amostras por meio do preparo automatizado de amostras e extração lipídica em um formato de 96 poços^40,41. Isso permite implementar a análise lipidômica em estudos clínicos e toxicológicos em larga escala.

No presente trabalho, realizamos a aquisição dos modos positivo e negativo do MS separadamente, sem troca de polaridade, como descrito por Schuhmann et ^al.42. A estabilidade do sinal do nanomate é melhor no modo negativo para uma solução ligeiramente menos concentrada do que no modo positivo. Além disso, desenvolvemos um procedimento totalmente rastreável com software conversor de arquivos .raw para mzML, que fornece os valores a serem especificados no software LipidXplorer – com isso, cálculos de inclinação de resolução manual não são necessários. Também aplicamos diferentes substituições de ajuste de ruído porque, no modo positivo, os níveis de ruído dos espectros são maiores do que no modo negativo. Todas as etapas foram otimizadas para análises de rotina rastreáveis e de alto rendimento.

Para identificação, a análise lipidômica shotgun pode explorar o comportamento único de diferentes classes lipídicas, que formam adutos únicos em diferentes modos de polaridade. Neste método, espécies de PC e PE com a mesma massa molecular que se sobrepõem no modo de ionização positiva podem ser completamente separadas no modo de ionização negativa, pois PC forma adutos de acetato ou formato, e PE é ionizado em uma forma desprotonada. Além disso, a deconvolução estrutural (parcial) é possível para o método utilizando não apenas a fórmula molecular, mas também a estrutura de ácidos graxos em massa. Por exemplo, a identificação de AG no nível de carbono total e contagem de insaturação total funciona para todos os fosfolipídios, DAGs, TAGs e lisofosfolipídios. A quantificação bottom-up de cada forma isomérica pode ser parcialmente realizada para algumas das classes de fosfolipídios⁴³ , mas é muito mais complexa para DAGs e TAGs devido à resposta desigual ao sinal de diferentes AGs nos espectros MS2.

Também é importante enfatizar a necessidade de implementar procedimentos adequados de controle de qualidade, totalmente alinhados com as recentes iniciativas nesse campo⁴⁴. Como desejamos garantir a rastreabilidade e a reprodutibilidade adequada dos dados entre e dentro do laboratório, uma série de etapas foram tomadas, como a randomização adequada das amostras para todas as etapas da análise, o trabalho com misturas padrão certificadas pelo fornecedor, a inclusão de amostras de controle de qualidade, procedimentos para verificar a aceitação ou rejeição do lote e a criação de um banco de dados interno para acompanhar o desempenho do CQ a longo prazo. Também consistente com essas iniciativas é a necessidade de um método padronizado para abordar a estabilidade da amostra. Em geral, a maioria dos lipídios estruturais não é impactada pela oxidação lipídica, que é mais relevante para oxilipinas, lipídios oxidados e ácidos graxos poli-insaturados, que são, portanto, muito mais sensíveis às condições de armazenamento e manuseio. No entanto, a correta avaliação da estabilidade da amostra ainda é uma tarefa tecnicamente desafiadora.

No entanto, este protocolo tem uma limitação quando se trata de determinar níveis submoleculares de compostos. Considerando que não há separação do extrato total, todas as isoformas de lipídios com a mesma massa molecular, mas diferentes composições de ácidos graxos são fundidas na análise de EM. Para a maioria das classes, é possível obter deconvolução parcial da estrutura usando as razões de fragmentação de fragmentos residuais de ácidos graxos em MS2. No entanto, a quantificação independente de cada isoforma continua sendo uma tarefa particularmente desafiadora devido às grandes diferenças nos comportamentos de fragmentação de diferentes isoformas e ao fato de que padrões químicos puros não estão disponíveis em grande variedade o suficiente para definir os valores de compensação. Outra limitação é que o processo de ESI inevitavelmente gera artefatos, resultando na geração artificial de picos para alguns lipídios, como DAGs, Pas e AGs, o que pode levar a quantificações errôneas.

A seguir, resumimos as partes mais críticas do protocolo com base em nossa experiência. A primeira está relacionada ao fato de que cada tipo de tecido de camundongo tem um perfil lipídico único em termos de quantidade lipídica e razões de classe. Com isso, as quantidades iniciais do tecido com base no conteúdo de proteína total antes da extração devem ser cuidadosamente determinadas para não saturar o sinal de MS e não sair da faixa de quantificação dinâmica devido à agregação lipídica em altas concentrações³³ ou – no extremo oposto – fornecer sinal MS suficiente para cobrir os principais compostos lipídicos para cada classe lipídica.

O segundo aspecto crítico é garantir um alinhamento adequado da posição da saída do chip de nanofonte de infusão direta com o capilar de transferência do espectrômetro de massa. Considerando que a calibração completa do espectrômetro de massa em ambos os modos é realizada semanalmente, a troca entre a fonte de calibração e a configuração do chip da nanofonte pode ser a razão para uma variabilidade dramática na intensidade do sinal devido ao desalinhamento durante a instalação.

Outra parte crítica do protocolo é o manuseio cuidadoso da mistura de padrões internos. Como essa mistura contém uma quantidade significativa de diclorometano, uma vez aberta, ela deve ser consumida rapidamente para evitar armazenamento prolongado e usos múltiplos que levam à evaporação e mudança de concentração artificial. Além disso, é importante o manuseio consistente da mistura padrão após a remoção do armazenamento de -20 °C, uma vez que as diferenças de temperatura podem levar a inconsistências de volume durante a pipetagem com pipetas de almofada de ar. Uma opção seria substituir o diclorometano no tampão de ressuspensão padrão por metanol puro, o que poderia melhorar a conveniência de manuseio, mas poderia afetar negativamente a solubilidade de algumas classes lipídicas e, assim, diminuir a precisão de quantificação para essas classes lipídicas.

A parte crítica final é o processamento de dados. O fluxo de trabalho de processamento de dados está combinando a conversão de software Peak by Peak do formato .raw para .mzML, aplicando a média de varredura MS2 e a filtragem de ruído MS1 e MS2, bem como a coleta de pico e a compactação de dados. Como alternativa, o software Proteowizard também pode ser usado para conversão de dados, mas, neste caso, várias configurações no LipidXplorer devem ser definidas manualmente. Toda a complexidade da lipidômica shotgun está particularmente concentrada na etapa de deconvolução dos espectros MS1 e MS2 de injeção direta. O software de código aberto LipidXplorer importa os espectros convertidos do formato de arquivo mzML com base na precisão de massa, resolução de massa e a inclinação de sua mudança com o aumento de m/z. O software mescla vários espectros individuais de MS e MS/MS adquiridos dentro de uma execução de análise. Depois, ele alinha picos individuais dentro de diferentes tiragens de amostragem, e, em cada aglomerado de picos alinhados, substitui suas massas por sua massa média ponderada por intensidade única, enquanto suas abundâncias em cada arquivo de dados permanecem intocadas. Massas representativas de clusters de pico alinhados e intensidades de pico individuais são armazenadas em um banco de dados mestre de varredura. O banco de dados mestre de varredura contém todos os espectros MS1 e MS2 gerados para todas as amostras no lote e pode ser descomplicado para identificações lipídicas por consultas escritas na linguagem de consulta de fragmentação molecular (MFQL).

Em geral, o método abrange a identificação de lipídios DAG, TAG e SE com base no modo positivo e lipídios PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC e LPE com base na aquisição do modo negativo. Durante a identificação lipídica, a correção isotópica é realizada para MS1 e MS2, e intensidades ajustadas são relatadas no arquivo de saída .xlsx. Alternativamente, vários outros softwares estão disponíveis para processar dados de espingarda, como ALEX⁴⁵ e LipidHunter⁴⁶.

Os ácidos graxos – principais componentes nucleares e da membrana celular – são armazenados na forma de fosfolipídios para posterior conversão em moléculas bioativas. Eles podem ser convertidos pelas enzimas lisofosfolipídeas aciltransferases em lisofosfolipídios pela via de Lands⁴⁷. A enzima LPCAT3, por exemplo, é conhecida por apresentar alta especificidade para incorporar AA em intermediários de lisofosfatidilcolina e lisofosfatidilserina. A expressão relativamente alta dessas enzimas foi relatada dentro de células inflamatórias, como macrófagos alveolares e células epiteliais brônquicas⁴⁷, levando à liberação de maiores proporções relativas de fosfolipídios contendo AA nessas células. Entretanto, após sua liberação dos fosfolipídios de membrana pela fosfolipase A2, a conversão dos AGPI em vários tipos de mediadores lipídicos é catalisada por muitas enzimas⁴⁸. Além disso, esses AGPI podem se tornar substrato para a produção de prostaglandinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias via ação das enzimas ciclooxigenase (COX)-1 e COX-2⁴⁷. Os fosfolipídios são uma das fontes de mediadores lipídicos liberados em locais particulares onde esses mediadores são necessários para demonstrar seus efeitos biológicos.

O pulmão é um órgão complexo que compreende vários tipos de células, cada uma desempenhando papéis sobrepostos e de nicho na facilitação do desenvolvimento e função pulmonar normal. Poucos estudos foram feitos para isolar e traçar o perfil de diferentes tipos celulares no pulmão de camundongos ou humanos (por exemplo, células alveolares tipo 2)^49,50; outros tipos celulares pulmonares importantes não foram caracterizados. Outro estudo^{interessante51} foi realizado para isolar e realizar análise lipídica de células endoteliais, epiteliais, mesenquimais e mistas do pulmão de camundongos. Observou-se que a concentração de AGPI incorporados na PCO e PG foi enriquecida nas células imunes. Considerando o fato de que o SC induz um aumento de células imunes dentro do pulmão (4-5 vezes), avaliado pelo lavado broncoalveolar (LBA)⁵², as alterações lipídicas totais observadas neste estudo poderiam ser explicadas por um aumento cumulativo no recrutamento de células imunes no pulmão de camundongos.

Em conclusão, a distorção observada de ácidos graxos monoinsaturados e AGPI incorporados em fosfolipídios pode refletir o excesso de certos AGs dentro da célula e/ou constituir um recurso intracelular de precursores de oxilipina que são superproduzidos sob estresse oxidativo e condições inflamatórias. No entanto, dados adicionais sobre EPA livre, DHA e outras oxilipinas são essenciais para esclarecer esse ponto e estão fora do escopo da aplicação do método atual.