啮齿动物组织的霰弹枪脂质组学

所有涉及动物的程序均在由国际实验动物护理评估和认证协会认可并获得新加坡农业食品和兽医局许可的设施中进行，并得到机构动物护理和使用委员会的批准，并符合国家实验动物研究咨询委员会关于科学目的护理和使用动物的指南（NACLAR， 2004). 1. 样品采集 在暴露于ApoE – / / – 小鼠3个月和6个月后进行小鼠肺解剖。暴露后16-24小时收集组织，在液氮中快速冷冻，并在启动脂质组学工作流程之前储存在-80°C。确保从每个“组学”解剖组中收集总共九个样本。 2. 组织 – 样品的粉碎 准备用于组织研磨的磁锤和耗材。预冷纸巾袋、镊子、带盖组织转移管、“V”型塑料刮刀和干冰上的 2 mL 塑料收集管。将相应的管架安装在磁锤仪器上。打开磁锤并将冲击力设置为 高。 将样品装入纸巾袋中;如果需要，使用预冷的镊子将样品插入组织袋的顶部开口。将样品放在柔性袋的中心，远离边缘。 通过将预冷的收集管拧到纸巾袋的顶部来密封纸巾袋。 通过将柔性袋浸入液氮中 10 秒来快速冷冻样品。 排气收集管;松开管子 1/4 圈进行排气，以避免在磁锤撞击时使袋子破裂。 将冷冻纸巾袋装入磁锤上。 按下 激活 按钮应用磁锤以粉碎样品。如果袋中残留有未粉碎的组织碎片，请再次在液氮中快速冷冻样品并重复第二次冲击。 从磁锤上取出纸巾袋，将粉碎的样品保持在底部。为防止样品融化，请立即再次快速冷冻。 将样品转移到收集管中。快速倒置管，使组织袋位于顶部，并敲击袋以将组织颗粒转移到收集管的底部。注意：此步骤应快速完成，以避免组织融化。 将10mg组织等分试样转移到2 mL管中进行进一步的脂质组学分析，并将样品储存在-80°C，直到执行进一步的步骤。 3. 组织均质化 打开组织裂解器仪器，将 振荡频率 设置为 30 Hz ， 振荡持续时间 设置为 2分钟。制备组织匀浆缓冲溶液：150mM碳酸氢铵在水中，pH值为~8.2。 从储存冰箱中取出样品，放在冰上，然后将四个不锈钢珠子加入装有组织粉末的管中。向每个样品中加入 0.5 mL 的 150 mM 碳酸氢铵缓冲液。 将样品管放入组织裂解器支架中。用相同数量的管子平衡两个支架。将支架固定到组织裂解器固定臂中。破坏组织。 将试管放在冰上，目视检查试管中是否存在残留的组织聚集体。如果组织破碎不完全（可见聚集体），则通过执行另一个治疗周期重复破坏过程。将样品放在冰上。 在专用于蛋白质测定的 1.5 mL 管中制备 100 μL 样品的等 分试样 1 。在10°C下以18，200× g 离心5分钟。 通过布拉德福德测定法测定等 分试样1 的蛋白质含量（见第4节）。将样品储存在冰上。 在新的 2 mL 微管中制备 20-100 μL 原液匀浆的等 分试样 2 ，用于脂质提取（参见第 5 节）。如果未立即分析样品，请将其保存在冰上，直到进行提取。注意：最终提取量必须根据总蛋白质量定义。它必须在每总等分试样 0.015-0.045 毫克蛋白质的范围内。 4. 布拉德福德蛋白测定法 注意：研究样品应在分析开始前随机化，并且样品处理的所有步骤都遵循随机化。 用碳酸氢铵缓冲液稀释等 分试样1 上清液2x。注意：稀释系数取决于组织匀浆的浓度。对于更浓缩的溶液，应用更高的因子，使确定的浓度落在测定的动态范围内。 根据 表1制备牛血清白蛋白（BSA）标准曲线。涡旋标准管。在室温下以 18，200 × g 离心管 15 秒。 从先前制备的标准管中，根据 图1所示的板布局将空白和标准品各转移6 μL到96孔平底板上。 根据 图1中描述的板布局将先前制备的样品转移到96孔平底板上。 使用多通道移液器和混合物向每个孔中加入 250 μL Bradford 试剂。孵育5分钟。 使用读板器测量595nm波长处的吸光度。 根据标准曲线计算等分试样中的蛋白质浓度。注意：在计算蛋白质浓度时，应考虑程序开始时使用的稀释因子。 5. 浮肿提取 注意：避免使用低结合塑料管进行脂质组学提取，因为强有机溶剂会释放增塑剂并在样品分析过程中产生强背景。 在总空白 （TB）、内标空白 （ISB） 和质控样品 （QC） 的每个试管中制备 1.5 mL 管中加入 100 μL 碳酸氢铵溶液，考虑在每组 10 个样品之间放置 1 个 QC 样品。将所有样品放在冰上。 向所有 QC 样品中加入 10 μL 混合人血浆。将 10 μL 内标溶液加标到所有 ISB、QC 和研究样品（即除 TB 以外的所有样品）中。注意：对于质量控制材料，请使用任何混合的市售K2EDTA等离子体。在收到时，使用上述方案量化混合血浆中的脂质浓度，并将这些范围作为使用QC材料的所有分析的参考。NIST血浆仅用于更有针对性的应用或需要解决分析准确性的全局方法验证。 向每个样品中加入 300 μL −20 °C 丁醇/甲醇混合物 （3/1， v/v）。在室温下在恒温下以450× g 摇动10分钟。 加入 300 μL 庚烷/乙酸乙酯混合物 （3/1， v/v）。在室温下在恒温下以450× g 摇动10分钟。 加入 300 μL 1% 乙酸混合物。在室温下在恒温下在 恒温下摇 动5分钟×。在室温下以2，800× g 离心5分钟。将 360 μL 上相转移到新的 2 mL 自锁管中 2.注意：液-液萃取可能导致相边界的位置以样品依赖的方式移动，这可能导致上相的体积差异很小。如有必要，调整上层的收集量。 向水相管 1 中加入 320 μL 庚烷/乙酸乙酯 （3/1， v/v）。在室温下在恒温下以450 ×g 摇动5分钟。在室温下以2，800× g 离心5分钟。转移320μL上相，并与步骤5.11中的馏分合并。注意：如有必要，请调整上层的收集量。 向管 1 中的水相中加入 250 μL 庚烷/乙酸乙酯 （3/1， v/v）。在室温下在热混合器上以450× g 摇动5分钟。在室温下以2，800× g 离心5分钟。转移 200 μL 上相，并与管 2 中步骤 5.11 和步骤 5.15 中的馏分合并。注意：如有必要，请调整上层的收集量。 在真空浓缩器中蒸发至35°C干燥。注意：如果需要，干燥的样品可以储存在-20°C直至分析。 重新溶解在 300 μL MS 混合物溶液（7.5 mM 乙酸铵在异丙醇/甲醇/氯仿中的溶液，4：2：1 溶液）中。涡旋每个管5秒以确保所有东西都溶解。在4°C下以18，200× g 离心5分钟。 根据 图 2 中的板布局将 50 μL 的等分试样转移到微升板中，以进行正电离模式分析（第 1-6 列），并用 50 μL MS 混合溶液稀释。 根据 图 2 中的板布局将 20 μL 的等分试样转移到 MTP 板中，以进行负电离模式分析（第 7-12 列），并用 80 μL MS 混合物稀释。用箔纸包裹板，并在分析前保持在4°C。 6. 质谱分析 在分析前 5 天或更短时间内，按照制造商的说明在正负模式下校准质谱仪 （MS）。 预先安装直接输液纳米源，确保其与MS的转移毛细管正确对齐。 将4.1μm喷嘴芯片安装到芯片支架中并在软件中进行配置。 使用以下参数进行正负模式方法设置：气体压力为 1.25 psi;源电压为 1.1 kV;5 μL 样品进样体积;输出触点闭合 Rel1 持续 2.5 秒;5分钟的交货时间;板在4°C下冷却。 为正模式的直接输液机器人设置分析序列队列。 使用以下 MS 设置将 MS 方法设置为 正模式 ：将毛细管温度设置为 250 °C，将 S 透镜射频电平设置为 65.0。以 140，000 分辨率在 550-1000 m/z 范围内执行 0 至 1 分钟的全扫描 MS 采集，自动增益控制为 1 ×106，最长进样时间为 50 ms。应用锁定质量 680.48022。 在 17，500 分辨率下在 1 到 5 分钟的时间范围内设置数据无关的 MS/MS 采集方法，固定的第一质量为 250 m/z。在 1 × 105 和最大注入时间为 64 ms、碰撞能量为 20 NCE 和 1 m/z 的隔离窗口下，对 MS2 使用自动增益控制。使用夹杂物质量列表，范围为 550 至 1，000 m/z，质量步长为 1 Da。 对于 负模式下的采集，请在MS调谐文件中将 毛细管温度 设置为 250°C ， 将S-Lens RF电平 设置为 65.0 。使用以下MS方法设置：全扫描采集模式从0到1分钟，分辨率为140，000，覆盖400-940 m/z范围，自动增益控制为1×106;最长注入时间为50毫秒;使用锁质量 529.46262。 在运行 1 到 5 分钟之间以 17，500 的分辨率在 DIA 模式下设置 MS2 采集，固定的第一质量为 150 m/z;自动增益控制 1 × 105;64毫秒的最长注射时间;和35NCE的碰撞能量。使用从 400 到 940 的夹杂物质量列表，质量步长为 1 Da。 在MS软件中以 正 模式创建分析序列队列。等待样品采集由来自每个样品的直接输液机器人的接触闭合信号触发。 正模式分析完成后，为 负 模式的直接输液机器人创建序列队列。 在 负 模式下在MS软件中设置分析序列队列。 7. 数据处理 要将正负模式中的数据文件从.raw格式转换为 .mzML 格式，请使用转换器软件。注意：正模式和负模式的数据文件必须分开转换（因为它们的采集设置和噪声阈值不同）。填写以下设置以执行文件转换：MS 和 MS2 的噪声阈值因子分别为 3 和 5;激活MS和MS2的噪声消除功能，数据压缩，平均MS2扫描和峰值拾取。为正负模式设置TIC阈值（例如，10，000和5，000;根据特定仪器产生的特定样本的噪声水平定义）。在处理结束时生成 XLC 和 PDF 报告。 进行脂质鉴定。定义以下（示例）文件导入设置参数：选择窗口±0.5 Da（取决于MS方法中的选择窗口）;时间范围 2-300 秒（取决于 MS 方法中的扫描时间）;没有MS和MS2的校准质量数;从逐峰软件元数据文件（最小质量 [MS]）和（最小质量 [MS2]）传输并四舍五入质量范围;MS和MS2的容差分别为3 ppm和10 ppm;将 MS 和 MS2 阈值字段、频率滤波器、MS1 偏移量和 PMO 留空;选择MS和MS2的同位素校正;转换器元数据文件中的分辨率梯度作为（分辨率线性拟合 [MS]）和（分辨率线性拟合 [MS2]）传输。注意：由于采集设置不同，阳性和阴性模式下的脂质鉴定必须分开进行。 导入数据后，转到 “运行 ”菜单并上传MFQL文件以进行脂质鉴定。注：有关MFQL结构的详细信息，请参阅Herzog等人25的出版物。请参阅 https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library 中的 MFQL 文件的一些示例并查看讨论。用于数据处理的所有MFQL均在补充材料中提供。 通过将脂质特征的母离子质量强度除以标记内标的相应强度，然后将商乘以标记内标的浓度，在MS水平上量化鉴定的物质。标准化布拉德福德测定法测量的每量总蛋白质的最终脂质浓度。 8. 质量控制检查程序 注意：质量检查程序是验证方法技术重现性的重要步骤。为此，分析商业混合血浆以确定每批15个相同等分试样（共5批）在5天内不同脂质的内源性水平。请注意，在本例中，数据评估管道是使用 R 统计软件环境创建为 Shiny Web 应用程序。 将参考验收范围定义为为所有五个批次计算的平均值±3个标准差。 对每个分析批次应用“通过”验收规则：考虑到一种参比化合物代表一种脂质类别，90%的参比靶标必须通过。例如，如果 QC 验证中包含 15 个参考目标，请确保 13 个目标通过才能接受该批次。注意：换句话说，每种参比化合物必须通过68%的QC样品才能接受该脂质类别的数据。 如果研究批次不符合QC检查的验收标准，请重复该过程。 9. （相对）共轭脂肪酸量的估计 对于每个脂质类别，根据其MS2强度估计共轭脂肪酸的量。注意：由于碎裂和电离差异，推导值仅用于样品组之间的相对丰度比较，而不是例如估计特定脂肪酸对脂质类别的总共轭脂肪酸库的相对贡献。 通过相应内标脂肪酸片段的平均强度来标准化脂肪酸片段的MS2强度。根据内标的浓度和测量的组织重量，得出共轭脂肪酸的“标准化浓度”。将这些值汇总每个脂质类别，以估计每个样品中每种共轭脂肪酸的总量。 10. 统计分析 执行统计分析。为每个条件和相应的对照组拟合线性模型，并根据 log2 转换数据的 t 统计量计算 p 值。使用 Benjamini-Hochberg 错误发现率方法纠正多种测试效应。注意：调整后的p值<0.05的脂质被认为是差异丰度的。这里，在R统计环境26中进行统计分析。