Purification et identification de protéines spécifiques de type cellulaire à partir de tissus complexes à l’aide d’une lignée de souris mutante d’ARNt synthétase de méthionine

L’homéostasie protéique aberrante est causée par un déséquilibre dans la synthèse et la dégradation des protéines. Plusieurs maladies sont liées à des altérations de l’homéostasie des protéines. La caractéristique de certaines maladies est la présence d’agrégats dans différents endroits subcellulaires et zones du cerveau. L’homéostasie des protéines est non seulement importante dans la maladie, mais joue également un rôle crucial dans la fonction organique et cellulaire normale¹. Par exemple, la synthèse des protéines est nécessaire pour de nombreuses formes de plasticité neuronale^2,3, telle que déterminée par l’utilisation d’inhibiteurs chimiques qui bloquent la synthèse des protéines⁴. Cependant, il n’est pas clair dans quels types de cellules le protéome est modifié pour soutenir l’apprentissage et la mémoire, ni quelles protéines spécifiques dans chaque type cellulaire augmentent ou diminuent dans leur synthèse ou leur dégradation. Ainsi, une étude approfondie de l’homéostasie des protéines nécessite la capacité de différencier les protéomes provenant de types cellulaires spécifiques. En effet, l’identification de protéomes spécifiques au type cellulaire pour étudier les processus cellulaires se produisant dans un environnement multicellulaire a été un obstacle important en protéomique. Pour cette raison, nous avons développé une technique utilisant l’expression MetRS* combinée à des méthodes bio-orthogonales qui s’est avérée être un moyen efficace d’identifier et de purifier des protéomes spécifiques de type cellulaire, comblant cette lacune ^5,6,7.

L’expression d’un mutant MetRS* (MetRS L274G) permet le chargement de l’analogue non canonique de la méthionine ANL dans l’ARNt ^8,9 correspondant et son incorporation ultérieure dans les protéines. Lorsque l’expression de MetRS* est régulée par un promoteur spécifique au type cellulaire, l’acide aminé non canonique sera incorporé dans les protéines de manière sélective des cellules. Une fois que l’ANL est incorporée dans les protéines, elle peut être fonctionnalisée sélectivement par la chimie du clic et ensuite visualisée par imagerie (FUNCAT) ou par Western Immunoblot (BONCAT). Alternativement, les protéines peuvent être purifiées sélectivement et identifiées par spectrométrie de masse (MS). Grâce à cette technologie, nous avons créé une lignée de souris exprimant la protéine MetRS* sous le contrôle de la Cre recombinase. Compte tenu du nombre croissant de lignées Cre-mouse disponibles, le système MetRS* peut être utilisé dans n’importe quel domaine pour étudier n’importe quel type de cellule à partir de n’importe quel tissu pour lequel il existe une Cre-line. Le marquage des protéines avec ANL est possible in vitro ou in vivo, et ne modifie pas le comportement de la souris ou l’intégrité des protéines⁶. La durée de marquage peut être adaptée à la question scientifique de chaque chercheur, en marquant des protéines nouvellement synthétisées (temps de marquage plus courts) ou des protéomes entiers (temps de marquage plus longs). L’utilisation de cette technique est limitée par le nombre de cellules du type que le chercheur est prêt à étudier; Par conséquent, l’isolement des protéines à partir de types cellulaires à faible nombre ou à faible taux métabolique n’est pas possible par cette méthode. L’objectif de la méthode présentée est d’identifier des protéines/protéomes spécifiques au type cellulaire marqués in vivo. Dans ce protocole, nous décrivons comment marquer des protéomes spécifiques au type cellulaire avec ANL chez des souris vivantes et purifier les protéines marquées. Après purification, les protéines peuvent être identifiées par des protocoles de spectrométrie de masse^{de routine 5,10}. La réduction de la complexité de l’échantillon obtenue dans cette méthode par la purification sélective de protéines provenant de populations cellulaires spécifiques permet à l’expérimentateur de détecter des changements subtils dans les protéomes, par exemple, en réponse à des changements environnementaux. La purification des protéines marquées peut être réalisée en ~10 jours, sans compter l’analyse MS ou la période de marquage. Ici, nous décrivons deux méthodes d’administration d’ANL à des souris exprimant MetRS*, à savoir (1) l’ajout d’acide aminé dans l’eau potable et (2) l’introduction de LNA par injections intrapéritonéales. Quelle que soit la méthode choisie pour l’administration de l’ANL, les étapes d’isolement et de purification sont les mêmes (à partir de l’étape 2).