Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

La homeostasis aberrante de proteínas es causada por un desequilibrio en la síntesis y degradación de proteínas. Varias enfermedades están relacionadas con alteraciones en la homeostasis de proteínas. El sello distintivo de algunas enfermedades es la presencia de agregados en diferentes ubicaciones subcelulares y áreas cerebrales. La homeostasis proteica no sólo es importante en la enfermedad, sino que también desempeña un papel crucial en la función normal de los órganos y las células¹. Por ejemplo, la síntesis de proteínas es necesaria para muchas formas de plasticidad neuronal^2,3, determinada por el uso de inhibidores químicos que bloquean la síntesis de proteínas⁴. Sin embargo, no está claro en qué tipos de células se altera el proteoma para apoyar el aprendizaje y la memoria, ni se entiende qué proteínas específicas en cada tipo de célula aumentan o disminuyen en su síntesis o degradación. Por lo tanto, un estudio exhaustivo de la homeostasis de proteínas requiere la capacidad de diferenciar proteomas provenientes de tipos celulares específicos. De hecho, la identificación de proteomas específicos de tipo celular para estudiar los procesos celulares que ocurren en un entorno multicelular ha sido un obstáculo importante en proteómica. Por esta razón, desarrollamos una técnica que utiliza la expresión de MetRS* combinada con métodos bio-ortogonales que ha demostrado ser una forma efectiva de identificar y purificar proteomas específicos de tipo celular, llenando este vacío ^5,6,7.

La expresión de un mutante MetRS* (MetRS L274G) permite la carga del anl analfa de metionina no canónico en el ARNt ^8,9 correspondiente y su posterior incorporación a proteínas. Cuando la expresión de MetRS* está regulada por un promotor específico de tipo celular, el aminoácido no canónico se incorporará a las proteínas de manera selectiva de la célula. Una vez que se incorpora ANL en las proteínas, puede ser funcionalizada selectivamente por química de clics y posteriormente visualizada por imágenes (FUNCAT) o por Western Immunoblot (BONCAT). Alternativamente, las proteínas pueden purificarse selectivamente e identificarse mediante espectrometría de masas (EM). Usando esta tecnología, creamos una línea de ratón que expresa la proteína MetRS* bajo el control de la recombinasa Cre. Teniendo en cuenta el creciente número de líneas de ratón Cre disponibles, el sistema MetRS* se puede utilizar en cualquier campo para estudiar cualquier tipo de célula de cualquier tejido para el que exista una línea Cre. El marcaje de proteínas con ANL es posible in vitro o in vivo, y no altera el comportamiento del ratón ni la integridad de las proteínas⁶. El período de tiempo de etiquetado se puede adaptar a la pregunta científica de cada investigador, etiquetando proteínas recién sintetizadas (tiempos de etiquetado más cortos) o proteomas completos (tiempos de etiquetado más largos). El uso de esta técnica está limitado por el número de células del tipo que el investigador está dispuesto a estudiar; Por lo tanto, el aislamiento de proteínas de tipos celulares con números bajos o bajas tasas metabólicas no es posible por este método. El objetivo del método presentado es identificar proteínas/proteomas específicos del tipo celular marcados in vivo. En este protocolo, describimos cómo etiquetar proteomas específicos de tipo celular con ANL en ratones vivos y purificar las proteínas marcadas. Después de la purificación, las proteínas pueden ser identificadas por protocolos de espectrometría de masas de rutina ^5,10. La reducción de la complejidad de la muestra lograda en este método mediante la purificación selectiva de proteínas de poblaciones celulares específicas permite al experimentador detectar cambios sutiles en los proteomas, por ejemplo, en respuesta a cambios ambientales. La purificación de las proteínas marcadas se puede lograr en ~ 10 días, sin incluir el análisis de MS o el período de etiquetado. Aquí, describimos dos métodos para la administración de ANL a ratones que expresan MetRS*, a saber, (1) agregar el aminoácido en el agua potable y (2) introducir ANL mediante inyecciones intraperitoneales. Independientemente del método elegido para la administración de ANL, los pasos de aislamiento y purificación son los mismos (a partir del paso 2).