Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn
概要
Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.
Abstract
Het begrijpen van eiwithomeostase in vivo is de sleutel om te weten hoe de cellen werken in zowel fysiologische als ziekteomstandigheden. Het huidige protocol beschrijft in vivo etikettering en daaropvolgende zuivering van nieuw gesynthetiseerde eiwitten met behulp van een gemanipuleerde muislijn om eiwitetikettering naar specifieke cellulaire populaties te leiden. Het is een induceerbare lijn door Cre-recombinase-expressie van L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*), waardoor azidonorleucine (ANL) kan worden opgenomen in de eiwitten, die anders niet zullen optreden. Met behulp van de hier beschreven methode is het mogelijk om celtypespecifieke proteomen die in vivo zijn gelabeld te zuiveren en subtiele veranderingen in het eiwitgehalte te detecteren als gevolg van vermindering van de complexiteit van het monster.
Introduction
Afwijkende eiwithomeostase wordt veroorzaakt door een onbalans in eiwitsynthese en -afbraak. Verschillende ziekten zijn gerelateerd aan veranderingen in eiwithomeostase. Het kenmerk van sommige ziekten is de aanwezigheid van aggregaten op verschillende subcellulaire locaties en hersengebieden. Eiwithomeostase is niet alleen belangrijk bij ziekte, maar speelt ook een cruciale rol in de normale orgaan- en cellulaire functie1. Eiwitsynthese is bijvoorbeeld noodzakelijk voor vele vormen van neuronale plasticiteit 2,3, zoals bepaald door het gebruik van chemische remmers die eiwitsynthese blokkeren4. Het is echter niet duidelijk in welke celtypen het proteoom wordt gewijzigd om leren en geheugen te ondersteunen, noch wordt begrepen welke specifieke eiwitten in elk celtype toenemen of afnemen in hun synthese of afbraak. Een uitgebreide studie van eiwithomeostase vereist dus het vermogen om proteomen te onderscheiden die afkomstig zijn van specifieke celtypen. Inderdaad, de identificatie van celtype-specifieke proteomen om cellulaire processen te bestuderen die plaatsvinden in een meercellige omgeving is een belangrijke hindernis geweest in proteomics. Om deze reden hebben we een techniek ontwikkeld met behulp van MetRS* expressie in combinatie met bio-orthogonale methoden die bewezen heeft een effectieve manier te zijn om celtype specifieke proteomen te identificeren en te zuiveren, waardoor deze kloof 5,6,7 wordt opgevuld.
De expressie van een mutant MetRS* (MetRS L274G) maakt het mogelijk om het niet-canonieke methionine-analoog ANL in het overeenkomstige tRNA 8,9 te laden en vervolgens in eiwitten op te nemen. Wanneer metRS*-expressie wordt gereguleerd door een celtypespecifieke promotor, wordt het niet-canonieke aminozuur op een celselectieve manier in de eiwitten opgenomen. Zodra ANL in de eiwitten is opgenomen, kan het selectief worden gefunctionaliseerd door klikchemie en vervolgens worden gevisualiseerd door beeldvorming (FUNCAT) of door Western Immunoblot (BONCAT). Als alternatief kunnen eiwitten selectief worden gezuiverd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Met behulp van deze technologie creëerden we een muislijn die het MetRS*-eiwit tot expressie brengt onder controle van het Cre-recombinase. Gezien het toenemende aantal beschikbare Cre-muislijnen, kan het MetRS*-systeem op elk gebied worden gebruikt om elk celtype te bestuderen uit elk weefsel waarvoor een bestaande Cre-lijn bestaat. Eiwitetikettering met ANL is mogelijk in vitro of in vivo en verandert het gedrag van de muis of de eiwitintegriteit niet6. De etiketteringstijdspanne kan worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag van elke onderzoeker, waarbij nieuw gesynthetiseerde eiwitten (kortere etiketteringstijden) of hele proteomen (langere etiketteringstijden) worden geëtiketteerd. Het gebruik van deze techniek wordt beperkt door het aantal cellen van het type dat de onderzoeker bereid is te bestuderen; vandaar dat eiwitisolatie van celtypen met lage aantallen of lage stofwisselingen niet mogelijk is met deze methode. Het doel van de gepresenteerde methode is om celtype-specifieke eiwitten /proteomen te identificeren die in vivo zijn gelabeld. In dit protocol beschrijven we hoe we celtypespecifieke proteomen kunnen labelen met ANL in levende muizen en de gelabelde eiwitten kunnen zuiveren. Na zuivering kunnen eiwitten worden geïdentificeerd door routinematige massaspectrometrieprotocollen 5,10. De vermindering van de complexiteit van het monster die in deze methode wordt bereikt door de selectieve zuivering van eiwitten uit specifieke cellulaire populaties, stelt de experimentator in staat om subtiele veranderingen in proteomen te detecteren, bijvoorbeeld als reactie op veranderingen in de omgeving. Zuivering van de gelabelde eiwitten kan worden bereikt in ~ 10 dagen, exclusief de MS-analyse of de etiketteringsperiode. Hier beschrijven we twee methoden voor ANL-toediening aan MetRS * die muizen tot expressie brengen, namelijk (1) het toevoegen van het aminozuur in het drinkwater en (2) het introduceren van ANL door intraperitoneale injecties. Ongeacht de gekozen methode voor ANL-toediening, zijn de isolatie- en zuiveringsstappen hetzelfde (vanaf stap 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritische aspecten van het protocol zijn; de opname van negatieve controles, met voldoende biologische replicaties, ANL-toedieningsroute, hoeveelheid en duur, alkylering van de monsters, alkynconcentratie en eliminatie van β-mercaptoethanol bij gebruik van DST-alkyn.
Het is van cruciaal belang om negatieve controlemonsters op te nemen die afkomstig zijn van ANL-gelabelde dieren zonder Cre-driver en dus geen MetRS*-expressie. Deze monsters moeten worden onderworpen aan elke stap die in het …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C wordt gefinancierd door het Spaanse ministerie van Wetenschap en Innovatie (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), door de autonome gemeenschap Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) en MICINN (PID2020-113270RA-I00) subsidies. R. A-P wordt gefinancierd door de autonome gemeenschap Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. wordt gefinancierd door de Max Planck Society, een Advanced Investigator award van de European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis en DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Wij danken D.C. Dieterich en P. Landgraf voor hun technisch advies en de synthese van de DST-Alkyne. We bedanken E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast en de dierenfaciliteit van de MPI for Brain Research voor hun uitstekende ondersteuning. Wij danken Sandra Goebbels voor het delen van de Nex-Cre muislijn. Wij danken Antonio G. Carroggio voor zijn hulp bij de Engelse redactie. B.A-C. ontworpen, uitgevoerde en geanalyseerde experimenten. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., en S.t. D. voerde experimenten uit en analyseerde deze. B.A-C en E.M.S. ontwierpen experimenten en begeleidden het project, B.A-C schreef het artikel. Alle auteurs redigeerden het artikel.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
参考文献
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
