간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인
概要
여기에서, 우리는 바다 말미잘에서 조독 추출물을 얻고 용혈성 및 포스포리파제 활성을 검출하는 프로토콜을 기술한다.
Abstract
바다 말미네 독 조성물은 폴리펩티드 및 비단백질 분자를 포함한다. 세포 용해 성분은 새로운 분자 도구를 설계하기위한 높은 생명 공학 및 생물 의학적 잠재력을 가지고 있습니다. 바다 말미잘독은 선충류라고 불리는 외배엽 및 하위 세포 구조의 선 세포에 위치하며, 둘 다 바다 말미잘의 몸 전체에 분포합니다. 이 특성은 세포와 선충류가 다른 독성이없는 분자와 함께 독 성분을 방출하기 위해 용해되어야하기 때문에 도전을 의미합니다. 따라서, 먼저, 독은 조추출물(다양하고 다양한 분자와 조직 파편들의 혼합물)로부터 유래된다. 다음 단계는 특정 생체활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 것이다. 여기에서, 우리는 시탈리신의 존재를 확인하기 위해 바다 말미네 조추출물 및 생물검정을 수득하기 위한 효율적인 전략을 기술한다. 첫 번째 단계는 시세포 분해신을 방출하는 저렴하고 간단한 기술 (교반 및 동결 해동 사이클)을 포함합니다. 우리는 가장 높은 세포 용해 활성과 단백질 (건조 중량 20g에서 단백질 ~ 500mg)을 얻었습니다. 다음으로, 추출물의 폴리펩티드 복잡성을 SDS-PAGE 겔 검출에 의해 분석하였고, 10 kDa 내지 250 kDa 사이의 분자량을 갖는 단백질을 검출하였다. 용혈성 분석에서 우리는 양 적혈구를 사용하고 HU50 (11.1 ± 0.3 μg / mL)을 측정했습니다. 대조적으로, 조 추출물에서 포스포리파아제의 존재는 아가로스를 갖는 고체 배지에서 기질로서 달걀 노른자를 사용하여 결정되었다. 전반적으로,이 연구는 효율적이고 저렴한 프로토콜을 사용하여 조 추출물을 준비하고 복제 가능한 생물 분석을 적용하여 세포 분해물, 생명 공학 및 생물 의학 관심사를 가진 분자를 확인합니다.
Introduction
해양 동물은 생물학적 활성 화합물의 풍부한 공급원입니다. 최근 수십 년 동안, 바다 말미잘독의 조성은 용혈성, 세포독성, 효소적(포스포리파제, 프로테아제, 키티나제) 및 단백질 분해 활성에 대한 신경독성 활성 및 억제 효과를 갖는 다양한 폴리펩티드를 포함하기 때문에 과학적인 관심을 끌었다1. 또한, 이들 폴리펩티드는 생명공학 및 치료적 용도2,3에서 분자 도구의 개발을 위한 잠재적 공급원이다.
바다 말미잘독과 그 분자 성분에 대한 보고는 거의 없는데, 이는 독을 얻는 복잡성, 심지어 독소의 분리 및 특성화로 인한 것이다. 보고서에 사용 된 추출 방법은 독 생산과 관련이 있고 관련이없는 세포의 내용물을 용해시키고 비우는 것을 포함했습니다1.
모든 cnidarians의 특별한 특징은 단일 해부학 적 영역에 집중 된 독의 생산 및 방출을위한 시스템이 없다는 것입니다. 대신, 선충류는 독 4,5를 유지하는 구조입니다. 표피선 세포라고 불리는 다른 유형의 세포도 독소를 분비하며 바다 말미잘6의 몸 전체에 분포합니다.
독을 얻는 데있어 첫 번째이자 가장 중요한 도전은 불안정한 단백질의 불활성화 또는 분해없이 후속 과정에서 충분한 조작을 가진 추출물을 생성하는 것입니다. 다음에, 세포는 용해되어야 하고, 성분-이 경우, 폴리펩티드는 효율적이고 신속하게 추출되어야 하며, 단백질 분해 및 가수분해를 피하면서 다른 세포 성분(7)을 제거해야 한다.
바다 말미잘의 조추출물을 얻기 위해 상이한 방법이 사용된다; 일부는 유기체를 희생시키는 것을 포함하고 다른 일부는 유기체가 살아 있도록 허용합니다. 유기체의 전신의 사용을 암시하는 방법은 독9의 일부 구성 요소 만 추출하는 유기체를 살아 있게 유지하는 방법과 비교하여 독8에서 대부분의 독소를 방출 할 수 있습니다. 추출물의 제조는 생체내 또는 시험관내 방법(10)에 의해 약리학적 효과를 관찰하기 위한 전략을 포함하는 특정 생물검정을 통해 관심있는 물질의 존재 및 효능을 평가하는 것을 필요로 한다.
바다 말미네 독은 세포용해성 폴리펩티드, 기공형성 독소(PFTs)11, 및 포스포리파아제12를 함유하고; 이들 분자는 단백질-지질 상호작용, 암 치료의 분자 도구 및 나노기공3에 기초한 바이오센서 연구의 모델이다. 바다 말미네 PFTs의 분류는 5 kDa 내지 80 kDa의 크기 또는 분자량에 따라 수행된다. 가장 많이 연구되고 악티노포린11로 알려진 20kDa PFT는 항암, 항균 및 나노 기공 기반 바이오 센서와 같은 가능한 응용을위한 분자 도구 개발에서 생물 의학적 잠재력에 특히 관심이 있습니다. 포스포리파아제, 구체적으로는 포스포리파제 A2(PLA2)13을 포함하는 또 다른 시톨리신은 지방산을 방출하고 인지질을 가수분해하여 세포막을 불안정하게 만든다. 이러한 작용 메카니즘으로 인해, PLA2는 염증성 질환에서의 연구 및 응용을 위한 필수적인 모델이 될 것을 약속한다. 이는 세포막(14)에서의 지질 거동을 연구하기 위한 모델로서 작용할 수 있다.
여기에서, 우리는 바다 말미잘로부터 조추출물을 수득하기 위한 효율적인 프로토콜을 기술한다 Anthopleura dowii Verrill, 1869, 및 검출 용혈 및 포스포리파아제. 둘 다 새로운 분자 도구를 설계하기위한 주형으로 사용될 수있는 관련 독소입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
과학 및 산업의 다른 분야에서 응용 프로그램과 새로운 화합물에 대한 높은 수요는 독의 연구로 이어졌다. Venom은 새로운 분자 도구를 생성하기위한 주형 역할을하는 풍부한 분자 공급원을 나타냅니다. 그러나 이러한 독의 복잡성은 그것들을 얻고 연구하기 위해 다양한 방법의 구현과 조합을 필요로합니다.
여기에서, 우리는 동결건조된 표본으로 시작하여 다른 바다 말미잘?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)에 의해 지원되었으며, 보조금 번호 IT200819가 있습니다. 저자는이 원고의 영어 문법을 확인하기 위해 Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC에게 인정합니다. Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada)와 Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM)의 기술 지원. 우리는 또한 양의 피를 얻은 Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) 박사에게 감사드립니다. 우리는 특히 ICAT-UNAM의 José Saniger Blesa박사에게 비디오 녹화를 위한 실험실의 시설에 대해 감사드립니다.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
参考文献
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