Identification de l’activité hémolytique et phospholipase dans les extraits bruts d’anémones de mer par des essais biologiques simples
概要
Ici, nous décrivons un protocole pour obtenir un extrait de venin brut de l’anémone de mer et détecter son activité hémolytique et phospholipase.
Abstract
La composition du venin d’anémone de mer comprend des molécules de polypeptides et de non-protéines. Les composants cytolytiques ont un potentiel biotechnologique et biomédical élevé pour la conception de nouveaux outils moléculaires. Le venin d’anémone de mer se trouve dans les cellules glandulaires des structures ectodermiques et subcellulaires appelées nématocystes, qui sont toutes deux réparties dans tout le corps de l’anémone de mer. Cette caractéristique implique des défis car les cellules et le nématocyste doivent être lysés pour libérer les composants du venin avec d’autres molécules non toxiques. Par conséquent, tout d’abord, le venin est dérivé d’un extrait brut (mélange de molécules différentes et diverses et de débris tissulaires). L’étape suivante consiste à détecter les polypeptides avec des bioactivités spécifiques. Ici, nous décrivons une stratégie efficace pour obtenir l’extrait brut d’anémone de mer et un essai biologique pour identifier la présence de cytolysines. La première étape implique des techniques simples et peu coûteuses (cycle agité et congélation-décongélation) pour libérer des cytolysines. Nous avons obtenu l’activité cytolytique et les protéines les plus élevées (~ 500 mg de protéines à partir de 20 g de poids sec). Ensuite, la complexité polypeptidique de l’extrait a été analysée par le gel SDS-PAGE détectant des protéines de poids moléculaire compris entre 10 kDa et 250 kDa. Dans le test hémolytique, nous avons utilisé des globules rouges de mouton et déterminé HU50 (11,1 ± 0,3 μg / mL). En revanche, la présence de phospholipases dans l’extrait brut a été déterminée en utilisant du jaune d’œuf comme substrat dans un milieu solide avec de l’agarose. Dans l’ensemble, cette étude utilise un protocole efficace et peu coûteux pour préparer l’extrait brut et applique des essais biologiques reproductibles pour identifier les cytolysines, des molécules ayant des intérêts biotechnologiques et biomédicaux.
Introduction
Les animaux marins sont une riche source de composés biologiquement actifs. Au cours des dernières décennies, la composition du venin d’anémone de mer a attiré l’attention scientifique car elle comprend une diversité de polypeptides ayant une activité hémolytique, cytotoxique, enzymatique (phospholipase, protéase, chitinase), une activité neurotoxique et des effets inhibiteurs sur l’activité protéolytique1. De plus, ces polypeptides sont des sources potentielles pour le développement d’outils moléculaires à usage biotechnologique et thérapeutique 2,3.
Il existe peu de rapports sur le venin d’anémone de mer et ses composants moléculaires en raison de la complexité de l’obtention du venin, même de l’isolement et de la caractérisation des toxines. Les méthodes d’extraction utilisées dans les rapports impliquaient la lyse et la vidange du contenu des cellules qui sont liées et non liées à la production de venin1.
Une caractéristique particulière chez tous les cnidaires est l’absence d’un système de production et de libération du venin centralisé dans une seule région anatomique. Au lieu de cela, les nématocystes sont des structures qui gardent le venin 4,5. D’autres types de cellules, appelées cellules de la glande épidermique, sécrètent également des toxines et sont également distribuées dans tout le corps des anémones de mer6.
Le premier et le plus crucial défi dans l’obtention du venin est la génération d’un extrait avec une manipulation suffisante dans les processus ultérieurs, sans l’inactivation ou la dégradation des protéines labiles. Ensuite, les cellules doivent être lysées, et les composants – dans ce cas, les polypeptides doivent être extraits efficacement et rapidement, en évitant la protéolyse et l’hydrolyse tout en éliminant les autres composants cellulaires7.
Différentes méthodes sont utilisées pour obtenir l’extrait brut d’une anémone de mer; certains impliquent de sacrifier l’organisme tandis que d’autres permettent de le maintenir en vie. Les méthodes qui impliquent l’utilisation de tout le corps de l’organisme permettent la libération de la plupart des toxines du venin8, par rapport aux méthodes qui maintiennent les organismes en vie, qui n’extraient que certains composants du venin9. La préparation d’un extrait nécessite d’évaluer la présence et la puissance d’une substance d’intérêt par le biais d’un essai biologique spécifique, qui comprend des stratégies pour observer les effets pharmacologiques par des méthodes in vivo ou in vitro 10.
Le venin d’anémone de mer contient des polypeptides cytolytiques, des toxines formant des pores (PFT)11 et des phospholipases12; ces molécules sont des modèles dans l’étude de l’interaction protéine-lipide, des outils moléculaires dans le traitement du cancer et des biocapteurs basés sur le nanopore3. La classification des PFT d’anémone de mer est effectuée en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire, de 5 kDa à 80 kDa. Le PFT de 20 kDa, le plus étudié et le plus connu sous le nom d’actinoporines11, présente un intérêt particulier pour son potentiel biomédical dans le développement d’outils moléculaires pour des applications possibles comme biocapteurs anticancéreux, antimicrobiens et à base de nanopores. Une autre cytolysine, y compris les phospholipases, en particulier la phospholipase A2 (PLA2)13, libère un acide gras dû et hydrolyse les phospholipides, déstabilisant la membrane cellulaire. En raison de ce mécanisme d’action, PLA2 promet d’être un modèle essentiel pour l’étude et les applications dans les maladies inflammatoires. Il pourrait servir de modèle pour les études du comportement lipidique dans la membrane cellulaire14.
Ici, nous décrivons un protocole efficace pour obtenir l’extrait brut de l’anémone de mer Anthopleura dowii Verrill, 1869, et détecter les hémolysines et les phospholipases. Les deux sont des toxines pertinentes qui pourraient être utilisées comme modèle pour concevoir de nouveaux outils moléculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
La forte demande de nouveaux composés ayant des applications dans différents domaines de la science et de l’industrie a conduit à l’étude du venin. Venom représente une riche source de molécules qui sert de modèle pour générer de nouveaux outils moléculaires. Cependant, la complexité de ces venins nécessite la mise en œuvre et la combinaison de diverses méthodes pour les obtenir et les étudier.
Ici, nous montrons une méthode pour obtenir et analyser le venin de l’anémone…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), avec le numéro de subvention IT200819. Les auteurs remercient Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, d’avoir vérifié la grammaire anglaise de ce manuscrit; et l’assistance technique de Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) et Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Nous remercions également le Dr Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) pour l’obtention de sang de mouton. Nous remercions tout particulièrement le Dr José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, pour les installations de son laboratoire pour l’enregistrement vidéo.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
参考文献
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
