Identificatie van hemolytische en fosfolipase-activiteit in ruwe extracten van zeeanemonen door Eenvoudige Bioassays

Zeedieren zijn een rijke bron van biologisch actieve verbindingen. In de afgelopen decennia heeft de samenstelling van zeeanemoongif wetenschappelijke aandacht getrokken, omdat het een diversiteit aan polypeptiden omvat met hemolytische, cytotoxische, enzymatische (fosfolipase, protease, chitinase) en neurotoxische activiteit en remmende effecten op proteolytische activiteit¹. Bovendien zijn deze polypeptiden potentiële bronnen voor de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen in biotechnologisch en therapeutisch gebruik ^2,3.

Er zijn weinig rapporten over zeeanemoongif en zijn moleculaire componenten vanwege de complexiteit van het verkrijgen van het gif, zelfs isolatie en karakterisering van toxines. De extractiemethoden die in de rapporten werden gebruikt, betroffen lysis en het legen van de inhoud van cellen die gerelateerd en niet gerelateerd zijn aan de gifproductie¹.

Een bijzonder kenmerk in alle cnidarians is de afwezigheid van een systeem voor productie en afgifte van het gif gecentraliseerd in een enkel anatomisch gebied. In plaats daarvan zijn de nematocysten structuren die het gif ^{4,5 houden}. Andere soorten cellen, epidermale kliercellen genaamd, scheiden ook toxines af en zijn ook verdeeld over het lichaam van zeeanemonen⁶.

De eerste en meest cruciale uitdaging bij het verkrijgen van het gif is het genereren van een extract met voldoende manipulatie in daaropvolgende processen, zonder de inactivatie of afbraak van labiele eiwitten. Vervolgens moeten de cellen worden gelyseerd en moeten de componenten – in dit geval polypeptiden – efficiënt en snel worden geëxtraheerd, waarbij proteolyse en hydrolyse worden vermeden terwijl andere cellulaire componenten worden^{geëlimineerd 7}.

Verschillende methoden worden gebruikt om het ruwe extract van een zeeanemoon te verkrijgen; sommige omvatten het opofferen van het organisme, terwijl anderen toestaan dat het in leven wordt gehouden. Methoden die het gebruik van het hele lichaam van het organisme impliceren, zorgen voor de afgifte van de meeste toxines uit het gif⁸, vergeleken met methoden die organismen in leven houden, die slechts enkele componenten van het gif⁹ extraheren. De bereiding van een extract vereist een evaluatie van de aanwezigheid en potentie van een stof van belang door middel van een specifieke bioassay, die strategieën omvat om de farmacologische effecten te observeren met behulp van in vivo of in vitro methoden¹⁰.

Zeeanemoongif bevat cytolytische polypeptiden, porievormende toxines (PFT’s)¹¹ en fosfolipase¹²; deze moleculen zijn modellen in de studie van eiwit-lipide interactie, moleculaire hulpmiddelen in kankertherapie en biosensoren op basis van nanopore³. De classificatie van zeeanemoon PFT’s wordt uitgevoerd op basis van hun grootte of molecuulgewicht, van 5 kDa tot 80 kDa. De 20 kDa PFT, de meest bestudeerde en bekend als actinoporinen¹¹, is van bijzonder belang vanwege zijn biomedische potentieel bij de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen voor mogelijke toepassingen als antikanker, antimicrobiële en op nanoporiën gebaseerde biosensoren. Een ander cytolysine, waaronder fosfolipase, met name fosfolipase A2 (PLA2)¹³, geeft een vetzuur af en hydrolyseert fosfolipiden, waardoor het celmembraan wordt gedestabiliseerd. Door dit werkingsmechanisme belooft PLA2 een essentieel model te zijn voor de studie en toepassingen bij ontstekingsziekten. Het zou kunnen dienen als een model voor studies van lipidengedrag in het celmembraan¹⁴.

Hier beschrijven we een efficiënt protocol voor het verkrijgen van het ruwe extract van zeeanemoon Anthopleura dowii Verrill, 1869, en het detecteren van hemolysines en fosfolipases. Beide zijn relevante toxines die kunnen worden gebruikt als een sjabloon om nieuwe moleculaire hulpmiddelen te ontwerpen.