概要

المجهر البؤري لقياس ثلاثة أنماط من ديناميكيات مسام الانصهار في خلايا الكرومافين الكظرية

Published: March 16, 2022
doi:

概要

يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير متحدة البؤرة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية. تشمل أوضاع الاندماج هذه 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والتشغيل) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الانصهار ، 2) الاندماج ، الذي ينطوي على فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار الانكماشي ، الذي ينطوي على انكماش الحويصلة المنصهرة.

Abstract

يتوسط فتح وإغلاق المسام الانصهارية الديناميكية الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية وتحديد حركياتها. هنا ، يتضح بالتفصيل كيف تم استخدام المجهر البؤري في تركيبة مع تسجيل المشبك الرقعة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية في الزراعة الأولية. تشمل أوضاع الاندماج الثلاثة 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والجري) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، 2) الاندماج المتبقي ، الذي يتضمن فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار المتقلص ، الذي ينطوي على انكماش ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الاندماج حتى يندمج تماما في غشاء البلازما.

للكشف عن أوضاع الاندماج هذه ، تم تسمية غشاء البلازما عن طريق الإفراط في التعبير عن mNeonGreen المرتبط بمجال الأس الهيدروجيني للفوسفوليباز C δ (PH-mNG) ، والذي يرتبط بالفوسفاتيديلينوسيتول-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) في النشرة المواجهة للسيتوسول من غشاء البلازما. تم تحميل الحويصلات بالناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 للكشف عن إطلاق المحتوى الحويصلي. وتم تضمين Atto 655 في محلول الحمام للكشف عن إغلاق مسام الانصهار. تم تصوير هذه المجسات الفلورية الثلاثة في وقت واحد عند ~ 20-90 مللي ثانية لكل إطار في خلايا الكرومافين الحية للكشف عن فتح مسام الاندماج ، وإطلاق المحتوى ، وإغلاق مسام الاندماج ، وتغيرات حجم الحويصلة المنصهرة. تم وصف طريقة التحليل للتمييز بين ثلاثة أوضاع اندماج من قياسات التألق هذه. يمكن أن تنطبق الطريقة الموصوفة هنا ، من حيث المبدأ ، على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.

Introduction

يتوسط الاندماج الغشائي العديد من الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك الانتقال المشبكي ، وتوازن الجلوكوز في الدم ، والاستجابة المناعية ، والدخول الفيروسي1،2،3. إفراز الخلايا الخارجية ، الذي ينطوي على اندماج الحويصلة في غشاء البلازما ، يطلق الناقلات العصبية والهرمونات لتحقيق العديد من الوظائف الهامة ، مثل أنشطة الشبكة العصبية. يفتح الانصهار مسام لإطلاق محتويات حويصلية ، وبعد ذلك قد تغلق المسام لاسترداد الحويصلة المنصهرة ، والتي تسمى قبلة وتشغيل 1,4. يمكن قياس كل من فتحة مسام الاندماج التي لا رجعة فيها وعكسها باستخدام تسجيلات السعة المرفقة بالخلايا جنبا إلى جنب مع تسجيلات توصيل مسام الاندماج لاندماج حويصلة واحدة.

غالبا ما يفسر هذا على أنه يعكس اندماج كامل الانهيار ، بما في ذلك تمدد الاندماج حتى تسطيح حويصلة الصمامات ، والتقبيل والتشغيل ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، على التوالي5،6،7،8،9،10،11،12،13 . لاحظت الدراسات التصويرية الحديثة لاستنفاد الانبعاثات البؤرية والمحفزة (STED) في خلايا الكرومافين مباشرة فتح وإغلاق مسام الاندماج (قبلة وتشغيل ، وتسمى أيضا الانصهار القريب) ، وفتح مسام الاندماج الذي يحافظ على شكل Ω مع مسام مفتوحة لفترة طويلة ، يسمى الاندماج المتبقي ، وتقلص حويصلة الصمامات حتى تكتمل مع غشاء البلازما ، الذي يحل محل الاندماج الكامل لدمج الحويصلات الاندماجية مع غشاء البلازما4 ، 8,14,15,16,17.

في الخلايا العصبية، تم الكشف عن فتح وإغلاق مسام الاندماج مع التصوير الذي يظهر إطلاق النقاط الكمومية المحملة مسبقا في الحويصلات التي هي أكبر من مسام الاندماج ومع قياسات توصيل مسام الاندماج في وجه إطلاق المحطات العصبية5،18،19. تستخدم خلايا الكرومافين الكظرية على نطاق واسع كنموذج لدراسة كثرة الخلايا الخارجية والداخلية20,21. على الرغم من أن خلايا الكرومافين تحتوي على حويصلات كبيرة كثيفة النواة ، في حين أن المشابك العصبية تحتوي على حويصلات متشابكة صغيرة ، فإن بروتينات الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا الكرومافين والمشابك العصبية متشابهة تماما 10,11,12,20,21,22,23.

هنا ، يتم وصف طريقة لقياس أوضاع الاندماج الثلاثة هذه باستخدام طريقة تصوير متحدة البؤرة جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية (الشكل 1). تتضمن هذه الطريقة تحميل الناقلات العصبية الكاذبة الفلورية (FFN511) في الحويصلات للكشف عن الإفرازات الخارجية. إضافة Atto 655 (A655) في محلول الحمام لملء ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الانصهار ، ووضع علامات على غشاء البلازما مع مجال PH من δ الفوسفوليباز C (PH) ، والذي يرتبط ب PtdIns(4,5)P2 في غشاء البلازما 8,15,24. يمكن الكشف عن ديناميكيات المسام الانصهارية من خلال التغيرات في كثافة الفلورسنت المختلفة. على الرغم من وصفها لخلايا الكرومافين ، إلا أن مبدأ هذه الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقه على نطاق واسع على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.

Protocol

ملاحظة: اتبع إجراء استخدام الحيوانات إرشادات المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المعاهد الوطنية للصحة. 1. زراعة خلايا الكرومافين البقرية قم بإعداد حل لوك (الجدول 1) وأدوات الأوتوكلاف قبل يوم واحد من زراعة…

Representative Results

وباتباع الإجراءات التجريبية المبينة في الشكل 1 والشكل 2، تم نقل خلايا الكرومافين من الغدد الكظرية البقرية باستخدام PH-mNG لوضع علامة على غشاء البلازما؛ تمت إضافة A655 إلى محلول الحمام للكشف عن إغلاق مسام الانصهار. وتم تحميل الناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 ف?…

Discussion

يتم وصف طريقة التصوير المجهري البؤري للكشف عن ديناميكيات مسام الاندماج وإطلاق جهاز الإرسال ، بالإضافة إلى ثلاثة أوضاع اندماج ، اندماج وثيق ، اندماج البقاء ، وانكماش الانصهار في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية 4,24. يتم وصف طريقة الفيزيولوجيا الكهربية ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر برامج البحوث الداخلية NINDS (ZIA NS003009-13 و ZIA NS003105-08) على دعم هذا العمل.

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

参考文献

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).

Play Video

記事を引用
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

View Video