Dosage standard d’alimentation par membrane pour la détection de l’infection à Plasmodium falciparum chez les moustiques vecteurs anophèles
概要
Le test standard d’alimentation membranaire (SMFA) est considéré comme l’étalon-or pour l’évaluation et l’identification de composés antipaludiques potentiels. Ce système d’alimentation artificiel est utilisé pour infecter les moustiques afin d’évaluer davantage les effets de ces composés sur l’intensité et la prévalence du parasite Plasmodium falciparum .
Abstract
Le paludisme reste l’une des maladies les plus dévastatrices au monde et, à ce jour, la Région africaine est toujours responsable de 94% de tous les cas dans le monde. Cette maladie parasitaire nécessite un parasite protozoaire, un moustique vecteur anophèle et un hôte vertébré. Le genre Anopheles comprend plus de 500 espèces, dont 60 sont connues comme vecteurs du parasite. Le genre de parasites Plasmodium comprend 250 espèces, dont 48 sont impliquées dans la transmission de maladies. En outre, le parasite Plasmodium falciparum a contribué à environ 99,7% des cas de paludisme en Afrique subsaharienne ces dernières années.
Les gamétocytes font partie du stade sexuel du parasite et sont ingérés par le moustique femelle lorsqu’il se nourrit d’un hôte humain infecté. Le développement ultérieur du parasite dans le moustique est renforcé par des conditions environnementales favorables dans l’intestin moyen du moustique. Ici, la fusion des gamètes femelles et mâles a lieu, et les oocinètes mobiles sont originaires. Les oocinètes pénètrent dans l’épithélium de l’intestin moyen du moustique et les oocinètes matures forment des oocystes, qui, à leur tour, produisent des sporozoïtes mobiles. Ces sporozoïtes migrent vers les glandes salivaires du moustique et sont injectés lorsqu’un moustique prend un repas de sang.
À des fins de découverte de médicaments, les moustiques ont été artificiellement infectés par du sang infecté par des gamétocytes dans le test standard d’alimentation par membrane (SMFA). Pour détecter l’infection chez le moustique et/ou évaluer l’efficacité des composés antipaludiques, l’intestin moyen des moustiques femelles a été enlevé après l’infection et a été coloré avec du mercurochrome. Cette méthode a été utilisée pour améliorer la détection visuelle des oocystes au microscope afin de déterminer avec précision la prévalence et l’intensité des oocystes.
Introduction
Le paludisme, connu comme l’une des maladies les plus destructrices au monde, constitue toujours une grande menace pour plusieurs pays, en particulier ceux de la région africaine, et contribue à environ 95% des cas dans le monde1. Cette maladie est causée par un parasite protozoaire et, avec son moustique vecteur Anopheles, ces coupables peuvent causer de grands dommages à l’hôte humain2. Plus précisément, l’espèce falciparum du genre parasite Plasmodium est responsable d’environ 99% des cas de paludisme en Afrique subsaharienne1. En outre, plusieurs vecteurs majeurs de moustiques anophèles (y compris An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., et An. funestus Giles) pourraient être blâmés pour plus de 95% de la transmission du parasite dans le monde 3,4,5,6,7,8 . Pour que la compagnie parasite-vecteur idéale soit établie, le moustique vecteur doit être sensible au parasite et être capable de le transmettre9. En outre, le vecteur et le parasite doivent surmonter les barrières physiques pour former la combinaison infectieuse parfaite – le moustique vecteur doit être capable de soutenir le développement du parasite, et le parasite doit avoir la capacité de surmonter les mécanismes de défense de l’hôte10,11.
Les gamétocytes, le stade sexuel du parasite P. falciparum, jouent un rôle crucial dans la connexion des partenaires vecteurs et parasites12. Le développement sexuel a lieu in vivo, et la gamétocytogenèse décrit le processus de différenciation des gamétocytes matures en microgamètes mâles mobiles et macrogamètes femelles13. Un autre processus qui a lieu à l’intérieur du moustique est l’exflagellation – le processus au cours duquel le gamétocyte mâle se transforme en gamètes et émerge des globules rouges absorbés lors d’un repas de sang11. Le processus d’exflagellation est en outre suggéré d’être amélioré par un changement favorable dans l’environnement de l’intestin moyendu moustique 14. Après exflagellation, un zygote est formé par la fusion des gamètes mâle et femelle13. Du zygote, un oocinète mobile apparaît et se déplace du repas de sang à l’épithélium de l’intestin moyen du moustique13. Ici, l’oocinète mûrit et un oocyste se forme, qui, à son tour, produit des sporozoïtes mobiles13,15. Les sporozoïtes migrent ensuite vers les glandes salivaires du moustique et, comme le moustique prend un repas de sang de son hôte, ces sporozoïtes sont injectés dans la circulation sanguine de l’hôte15.
Les interventions de lutte contre le paludisme, combinant des stratégies de lutte antivectorielle et l’utilisation de médicaments antipaludiques efficaces, sont devenues cruciales dans la lutte contre cette maladie15. Avec l’augmentation de la résistance aux parasites et aux moustiques, l’urgence d’identifier de nouveaux composés antipaludiques augmente16. Par conséquent, l’évaluation in vivo des composés bloquant la transmission est importante16. Après la mise au point de tels médicaments efficaces bloquant la transmission, le SMFA a été utilisé pour évaluer si ces composés inhibent le développement sexuel de P. falciparum chez le moustique anophèle 17,18,19. Ce test a été reconnu depuis les années 1970-1980 comme l’étalon-or pour évaluer le blocage de transmission20,21. Ce test offre une alternative moins chère que d’autres tests tels que la RT-qPCR, qui nécessite un équipement spécialisé. De plus, aucun patient n’est nécessaire pour exécuter les expériences. Ce test implique également l’apport de sang induit par les gamétocytes aux moustiques femelles, qui sont ensuite disséqués pour évaluer si le développement d’oocystes est présent21. Cela permet la quantification des gamétocytes et la détection des oocystes déformés à cause des composés22. Pour qu’un composé soit classé comme efficace, la prévalence (la proportion de moustiques qui hébergent au moins un oocyste dans l’intestin moyen) et le nombre d’oocystes (intensité) dans l’intestin moyen du moustique doivent être évalués pour évaluer l’inhibition de l’infection 17,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour que ce protocole soit exécuté avec succès, une attention particulière doit être accordée à chaque étape, même s’il peut s’agir d’un processus fastidieux et laborieux. L’une des étapes les plus importantes est de s’assurer que la culture des gamétocytes est de bonne qualité et qu’elle est constituée de gamétocytes matures, avec le bon ratio mâle/femelle, avant de commencer le SMFA23,24. Pendant la SMFA, il est également crucial de …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercierProf. Lyn-Mari Birkholtz et le Dr Janette Reader du Département de biochimie, génétique et microbiologie de l’Institut de lutte durable contre le paludisme de l’Université de Pretoria pour la culture et la fourniture de la culture de gamétocytes. La souche parasitaire a été obtenue auprès de ce dernier département (ne faisant pas partie de cette publication). Le Département de la science et de l’innovation (DSI) et la Fondation nationale de la recherche (NRF); Initiative des chaires de recherche sud-africaines (UID 64763 à LK et UID 84627 à LMB); les communautés de pratique de la NRF (UID 110666 à LMB et LK); et le South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) sont également reconnus pour les fonds du DSI.
Materials
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
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