自己 カエノールハブディティス 線虫の生態学的調査を行うための高度にスケーラブルなアプローチ

1. コレクションの準備 Caenorhabditis線虫を調査する場所を特定する。注:ほとんどの温帯地域では、C. elegansとC. briggsaeは、農業畑や農村部や都市部の庭園などの人間関連の生息地から簡単に隔離できます1。亜熱帯および熱帯地域では、C. briggsae、C. elegans、およびC. tropicalisはすべて、上記の人間関連の生息地で、時には互いに近接して見つけることができます。しかし、C. elegansは熱帯生息地の他の種よりも涼しく乾燥した生息地を好むようです7,8。各種は、人間と関連していない野生の生息地から隔離することもできますが、これらの生息地はそれほど頻繁にサンプリングされません。 Fulcrum プロジェクトを作成して、モバイル・データ収集アプリケーションを使用して収集および分離データを編成します。 無料の教育契約を使用して、Fulcrumのアカウントをオンラインで作成します16。 線虫フィールドサンプリング アプリケーションをフルクラムアカウントに追加するには、[ APPを追加 ]ボタン17をクリックします。 線虫分離アプリケーションをアカウントに追加するには、[APPを追加]ボタン18をクリックします。注: ある場所への各旅行は、命名規則 ‘YearMonthLocation’ (例: 2020FebruaryAustralia) を使用してコレクション プロジェクトとして編成することをお勧めします。 ユーザーを Fulcrum アカウントに追加して、コレクション プロジェクトへのアクセス権を付与します。各ユーザーがプロジェクトに参加するために Fulcrum モバイル・アプリケーションをダウンロードしていることを確認します。 一連のQRコードラベルを印刷して、モバイルアプリケーションでコレクション(Cラベル)と線虫分離(Sラベル)を追跡します。Cラベルをジップロック式のビニール袋に取り付け、ラベルの付いた袋を25個のグループに丸め、梱包用のゴムバンドで包みます。実験室で使用するためにSラベルのセットを保管してください。注:このプロトコル全体を通して、コレクション(現場からの基板)はバッグまたはプレートに含まれ、Cラベルでラベル付けされています。単離された線虫はS標識で標識されている。Cラベルは固有のコレクションを識別するために使用され、Sラベルは一意の線虫分離株を識別するために使用されます。これら 2 種類のラベルは、Fulcrum データベース内の特定のコレクション (C ラベル) と、そのコレクションから分離された線虫 (S ラベル) との間の接続を行うために使用されます。コレクション プロジェクトの C ラベルとして 2 倍の数の S ラベルを印刷するのは、コレクションごとに平均して 2 つの線虫が分離されるためです。必要に応じて、後でより多くの S ラベルを印刷できます。2,500のユニークなCラベル(補足ファイル1)と5,000のユニークなSラベル(補足ファイル2)が補足で提供されています。 採取用に10cmのNGMAプレートを、線虫を単離するために3.5cmのNGMAプレートを準備する。10cmのプレートを1枚と3.5cmのプレートを2枚以上作成します21。これらのプレートに、確立されたプロトコールに従って 大腸菌 株OP50を播種する。使用前にプレートを4°Cで1ヶ月以内に保管してください。 2. フィールド収集 注:Caenorhabditis線虫は、果物、ナッツ、種子、さや、花、茎、植物性ゴミ、堆肥1,5,6,8を含む腐った植物材料から最も頻繁に単離されます。最高の基質は腐っていて、果物や花としてほとんど認識できません。基板が乾燥しすぎたり濡れたりしないようにします(図1)。基板は、ペアで作業することによって現場から最も効率的に収集されます。非接触赤外線温度計を持つ個人は、収集用の基板を選択してサンプルを収集し、パートナーはFulcrumの線虫フィールドサンプリングアプリケーションを使用して収集データを記録します。コレクタのペアは、必要な数のサンプルが収集されるまでこのプロセスを繰り返します。フィールドワークに必要な資料のリストは、(補足表1)にあります。 Fulcrum モバイル アプリを開き、ドロップダウン メニューから [ 線虫フィールド サンプリング] を選択します。 + を押して、プロジェクトで新しいレコードを開始します (図 2A)。基板の写真を撮ります。 上部中央のボックスをクリックして、手順1.2で作成した正しいコレクションプロジェクトを選択します(図2B)。コレクションレコードの下部にある Cラベル フィールドをタップし、プロンプトが表示されたら[スキャン]を選択します。モバイルデバイスのカメラを使用してコレクションバッグのバーコード をスキャンし 、画面の右上にある[ 完了 ]をタップします。 基板 フィールドを タップし、ドロップダウンメニューから基板タイプを選択します。基板に関するメモを追加するには、「基板 メモ」(Substrate Notes) フィールドをタップし、手動でメモを入力します。 ドロップダウンメニューからランドスケープを選択します。サンプリング サイトを最もよく表すランドスケープを選択します。 スカイビューを選択します。スカイビューを選択するときは、サンプリングサイトでの空の可視性を記述します(たとえば、木や他の構造物からの遮るもののないフルスカイビュー=フル)。 非接触温度計を用いて基板の表面温度を測定し、その値を基板温度フィールドに記録する。メモ: 温度を記録している間は、非接触温度計を基板から 14 インチ以内に離してください。 ハンドヘルドデバイスで周囲温度と湿度を測定し、これらのデータを適切なフィールドに記録します。メモ: 周囲温度および湿度デバイスが 保留になっていないことを確認します。ボタンを離すと測定単位が変わります。不規則な読み取りを避けるために、デバイスを外側のポケットに入れてください。 画面の左上にある [ 保存] をタップして、レコードを支点に保存します。 スティックやその他の硬い部分なしで大さじ1杯の基板を、収集袋を反転させて基板を拾うための「手袋」として使用し、袋を密封します。サンプルが特に湿っている場合は、ペーパータオルを袋に入れます。注:暑い気候では、コレクションを涼しく保つために、より涼しいパック付きの柔らかいクーラーにバッグを置きます。 その日のすべてのサンプルが収集されたら、収集機器を清掃し、プローブからバッテリーを取り出し、バッテリーを充電し、冷凍庫パックを再凍結します。線 虫フィールドサンプリング アプリケーションの左上にある同期ボタンをタップして、支点コレクションデータを同期します。注:アップロードには、強力な携帯電話接続がないと数分かかる場合があるため、WiFiアクセスを待つことをお勧めします。データはモバイルデバイスに残り、クラウドに同期されます。 サンプルを夜間配送箱に入れて、ホームインスティテューションに出荷します。貨物が輸送される日にパッケージを出荷することにより、サンプルが11°C未満または25°Cを超える温度にさらされる時間を最小限に抑えます。注:ほとんどの配送施設では、週末に遠隔地で一晩貨物を出荷することはありません。 3. 実験室でのめっき外フィールドコレクション 注: このセクションでは、ラベル付き収集バッグからラベル付きプレートへのサンプルの移送を整理する方法について説明します。サンプルは、一晩の出荷から、またはフィールドから直接到着することができます。 コレクションの貨物を受け取り、壊れたバッグやその他の損傷の証拠がないか検査します。袋が壊れている場合は、材料を捨て、壊れていない収集袋を70%エタノールで清掃してください。エタノールを含む袋のCラベルは、ラベルを変色させ、読みにくくするため、避けてください。 各ジップロックバッグについて、バッグのCラベルを書き留め、OP50細菌が付着した10cmプレートの蓋に一致するCラベルを貼り付けます。注: ラベルの付いた 10 cm プレートは、プロトコルの残りの部分では「C プレート」と呼ばれます。サンプルを整理する最も簡単な方法は、収集バッグをラボベンチに置き、その上に一致するCプレートを置くことです(図3)。 各コレクションについて、きれいなプラスチックスプーンを使用して、コレクションバッグから約1杯のサンプルをCプレートに移します。細菌芝生の周囲にサンプルを三日月またはリング状に添加し、細菌芝生を完全に覆わないでください(図4)。注:使用していないときは、大さじを95%エタノールのビーカーに入れて清潔に保ちます。追加のサンプルを移す前に、ペーパータオルを使用して大さじを乾かします。 コレクションが収集バッグからCプレートに移された時間を記録し、セクション4で線虫の単離を試みる前に、Cプレートを室温(RT)に少なくとも24時間保持する。 4.コレクションからの線虫の分離 モバイルデバイスで Fulcrum アプリケーションを開き、アプリケーションメニューから [線虫の分離] を選択します(図5A)。右下の+アイコンをタップして、新しい分離記録を作成します(図5B)。 新しい分離記録画面で、上部中央のボックスに表示されているプロジェクト名にチェックを入れて、正しい収集プロジェクトを確認します。間違ったプロジェクトが表示された場合は、プロジェクト名をタップして正しいプロジェクトに切り替えます(図5C)。 Cラベルフィールドの下にあるSelectボタンをタップして、線虫が単離されているサンプルに関連付けられているCラベルを見つけます(図5D)。検索アイコンをタップしてから、スキャンアイコンをタップして、デバイスのカメラでCプレート上のCラベルQRコードをスキャンします。QR コードがスキャンされると、C ラベル レコードが C ラベル フィールドに表示されます。 [写真]フィールドの[カメラ]アイコンをタップしてデバイスのカメラを開き、それを使用してQRコードが表示されたCプレート上のサンプルの写真を撮ります(図5E)。[完了]をタップして[分離]画面に戻ります。注:これらの分離記録写真は、後で基板の特定の属性を調べるために使用できます。 解剖顕微鏡を使用して、Cプレート上の線虫を探します。[サンプル上のワーム]フィールドをタップして、 サンプル上の 線虫の存在を記録します(図5F)。線虫がCプレート上に存在する場合は[ はい ]をタップし、線虫が存在しない場合は [いいえ ]をタップします。 線虫のトラックのみが存在する場合は、 トラック をタップします。線虫が存在しない場合は、Cプレートをパラフィルムし、バイオハザードビンに処分します。メモ:Cプレートをバイオハザード廃棄物箱の上に反転させ、プレートの背面を軽く叩いて、サンプリングしたすべての基板を外します。このステップにより、Cプレート上の基質の下にある線虫を見つけて単離することが容易になる。 線虫が存在する場合は、Cプレートから最大5つの線虫を単離する。線虫を単離するには、白金線ピックを使用して、1つの線虫をCプレートからSプレートに移す。可能であれば、健康でグラビッドな大人を隔離してください。ただし、成虫が見つからない場合は、他の段階を分離してください。注:単離後、最大5つのSプレートにそれぞれ1つの線虫が1つずつあります。同じCプレートから分離された線虫を持つこれらのSプレートは、支点に入るまで他のSプレートから離れたきれいなスタックにまとめてください。 「 S ラベルの付いたプレート」 フィールドをタップして、この分離に使用する S プレートを入力します。右下の + をタップします。 Sラベル をタップし、[ スキャン ]をクリックしてデバイスのカメラを開きます。デバイスのカメラを使用して、S プレート上の S ラベル QR コードをスキャンします。メモ: S ラベルのコードがプレートのコードと一致していることを確認します。一致する場合は、[ 完了]をタップします。そうでない場合は、[ キャンセル ]をタップして一致するまで再スキャンし、[ 完了]をクリックします。近くのプレートのQRコードが誤ってスキャンされることがあります。 各Sプレートを入力したら、右上の保存ボタンでエントリ を保存し ます。エントリは、保存されていない場合は失われます。右下の + をタップして、Cプレートから分離されたすべての線虫が入力されるまで、必要に応じてSラベルプレートを追加します。隔離記録にすべてのSラベル付きプレートを追加したら、左上の < ボタンをタップして隔離記録画面に戻ります。メモ: 間違いを解決できないために分離レコードをキャンセルするには、左上の [ キャンセル] をクリックします。この手順では、保存せずにレコードを破棄できるかどうかを尋ねるダイアログが開きます。必要に応じて、[ はい、破棄]をクリックします。 分離レコードにすべての情報が正しく追加されたら、右上の [保存] ボタンをタップします。次に、孤立した線虫でSプレートをパラフィルムし、線虫でSプレートを保持するように指定された領域にそれらを脇に置きます。 Cプレートをパラフィルム化し、バイオハザードビンに捨てます。 同期 アイコンをタップして、すべてのデータをフルクラムにアップロードします。 すべてのSプレートを英数字順にソートし、Sプレートを段ボール箱に入れます。Sプレートが蓋側を下にしてパラフィルムされていることを確認してください。箱の中の1つの位置に最大4枚のSプレートを積み重ね、段ボール箱にプロジェクト名、日付、時刻、および一意の箱番号のラベルを付けます。 ラベルの付いたボックスをRTに保管します。これらの分離株は、48時間で増殖し、必要に応じて168時間で再び増殖するかどうかチェックされます。 5. 支点からのSプレートの輸出 注: このセクションでは、分離プロセスで使用される S ラベルを Fulcrum プロジェクト データベースからエクスポートする方法について説明します。これらのS標識は、セクション6〜9の配列同一性によって同定されている間、増殖する等女性ラインを追跡するために使用される。 Fulcrum Web サイトにサインインし、 線虫分離 アプリケーションを選択します。画面の左側から [エクスポーター ]をクリックします。目的のプロジェクトをクリックして選択し、[ 線虫の分離] チェックボックスをオンにします。「 次へ 」をクリックして、「.zip」ファイルを含むnematode_isolation_s_labeled_plates.csvファイルをダウンロードします。 「nematode_isolation_s_labeled_plates.csv」ファイルを開き、「Sラベル」列で昇順にソートします(最小のSラベルが一番上に表示されます)。すべての S ラベルを選択し、スプレッドシートからコピーします。 ウェブブラウザを使用して、野生の分離ジェノタイピングテンプレートGoogleシート(wild_isolate_genotyping_template)に移動します19。 このGoogleシートのコピーを作成するには、[ ジェノタイピングテンプレート ]タブを右クリックし、[ 新しいスプレッドシートにコピー] オプションを選択します。[ スプレッドシートを開く] を選択して、新しい Google スプレッドシートを表示します。 この新しいシートには、支点プロジェクト名の後に ‘wild_isolate_genotyping’ を付けます (例: ‘2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping’)。注: このシートは、プロトコルの残りの部分で「ジェノタイピング シート」と呼ばれます。 「nematode_isolation_s_labeled_plates.csv」の「s_label」列からコピーしたSラベルを「s_label」というタイトルの遺伝子型シート列に貼り付けます。「s_label_repeat_error」列で「1」を確認してください。この列の値 ‘1’ は、S ラベルがジェノタイピング シートのどこかに複製されていることを意味します。重複が見つかった場合は、先に進む前に調査して修正してください。 すべてのSラベルのジェノタイピングシート「isolation_box_number」列に記入してください。 6. Sプレート上の拡散を確認する 隔離後48時間でSプレート上で動物が増殖していないか確認します(タイミングをガイドするには、ステップ4.11のボックス上の最後の隔離の日時を使用します)。注:増殖する線虫は、Sプレート上の子孫によって特徴付けられる。 Sプレートが増殖している場合は、遺伝子型決定シートのproliferation_48列に「1」と入力し、Sプレートを「48時間増殖、ボックス1」というラベルの付いたボックスに移動します。最大88枚のSプレートを増殖ボックスに入れ、「48時間増殖、ボックス2」というラベルの付いた新しいボックスの充填を開始します。S ラベルが 48 時間の拡散ボックスで英数字順に整理されていることを確認します。注:増殖しないSプレートを処分しないでください。これらのプレートは、絶縁後168時間で再度チェックされます。必要に応じて、これらの S プレートを「48 時間非増殖、ボックス X」というラベルの付いたボックスに番号順に統合しますが、新しいボックスで 168 時間のチェックをいつ行う必要があるかを記録することを忘れないでください。 48時間で増殖するすべてのSラベルを特定した後、48時間で増殖するSプレートのセクション7に進みます。 単離後48時間で増殖しなかったSプレートを、単離後168時間で再度確認してください。 現在、S プレートが増殖している場合は、ジェノタイピング シートの proliferation_168 列に「1」と入力し、S プレートを「168 時間増殖、ボックス 1」というラベルの付いたボックスに移動します。 最大88枚のSプレートを増殖ボックスに入れ、「168時間増殖、ボックス2」というラベルの付いた新しいボックスの充填を開始します。Sラベルは必ず英数字順に168時間拡散ボックスに整理してください。 168時間後に増殖しないSプレートを捨てる。168時間で増殖するSプレートのセクション7に進みます。 7.等女性線の溶解 注:この手順では、Googleスプレッドシートのデータフィルタツールを使用して、拡散ボックスのSプレートの溶解ワークシートを印刷します。溶解ワークシートの目的は、ベンチの溶解ストリップチューブ内のSラベルの正しい位置を人員に提供することです。 目的のプロジェクトのジェノタイピングシートを開き、 Cmd + Aと入力してすべてのセルを選択します。[ データ] > [フィルターの作成] をクリックして、各列ヘッダーにフィルター ボタンを追加します。 [フィルター] ボタンを使用して、遺伝子型決定される S プレートのみを表示します。たとえば、48時間で増殖するすべてのSプレートを溶解する場合、「proliferation_48」列の[フィルタ]ボタンをクリックし、[1]を選択します。 遺伝子型決定 Google シートがフィルター処理されたら、表示された S ラベルのリストを確認して、ワークシートに印刷する S ラベルであることを確認します。 ジェノタイピング Google シートの [strip_tube_number] 列に、11 行ごとに一意の番号を入力します。 プロジェクトのストリップチューブ番号を 1 から始まる連続した順序で入力し、重複することはありません。「strip_tube_position」に、ストリップチューブ番号ごとに2~12と入力します。注:溶解には12チューブストリップチューブを使用してください。最初の位置 (strip_tube_position 1) は管理対象になりますが、管理は溶解ワークシートに追加されません (strip_tube_positionsのみが追加されます (2 ~ 12)。溶解時には、陽性対照株’N2’が陽性対照として偶数番号帯状管毎の位置1に添加されることになる。ネガティブコントロールとして、奇数番号のストリップチューブのすべての位置1にワームは追加されません。 遺伝子型決定のGoogleシートをさらにフィルタリングして、溶解する1つの拡散ボックスにSラベルのみを含め、列「s_label」から「lysis_notes」を選択します。溶解する増殖ボックスごとに溶解ワークシートを印刷します。 [印刷] フィールドのドロップダウン メニューをクリックし、[選択したセル] を選択します。右上の[次へ]をクリックし、ダイアログを使用して拡散ボックスの溶解ワークシートを印刷します。 手順 7.3 ~ 7.5 を繰り返して、増殖ボックスごとに溶解ワークシートを印刷します。注:各増殖ボックスには最大88枚のSプレートが収納でき、これは8本の12ウェルストリップチューブに対応します。 溶解するすべてのサンプル用に12ウェルストリップチューブを準備します。ストリップチューブに、溶解ワークシートに割り当てられた一意の「strip_tube_number」でラベルを付けます。このラベルは、キャップストリップとストリップチューブが分離されている場合の混乱を避けるために、キャップストリップに書き込む必要があります。偶数ストリップチューブは、位置1にポジティブコントロール(N2ワーム)を有する。ODDストリップチューブは、位置1にネガティブコントロール(ワームなし)を有する。 すべてのサンプルに対して十分な溶解バッファー (100 mM KCl、20 mM Tris pH 8.2、5 mM MgCl2、0.9% IGEPAL、0.9% Tween 20、0.02% ゼラチン、プロテイナーゼ K を終濃度 0.4 mg/mL に添加) を作り、ピペットエラーのために 5% 余分に加えます。必要に応じてスケーリングします。注:溶解バッファーは、プロテイナーゼKを除くすべての成分を組み合わせて、-20°Cで10〜50mLのアリコートで凍結することによって最もよく調製されます。 アリコートを解凍し、使用前に4°Cに保ちます。使用直前にプロテイナーゼKを加え、よく混ぜる。作業中は溶解バッファーを氷の上に保管してください。 印刷された溶解ワークシートをガイドとして使用して、特定のストリップチューブ用のSプレートを順番に配置します。 ストリップチューブ1本をキャップを外し、繰り返しピペッターで各キャップに8μLの溶解バッファーを追加します。溶解バッファーを一度に 1 つのキャップストリップに加えるのは、RT に放置して覆い隠すと溶解バッファーが蒸発するためです。ソースプレート(陽性対照用のSプレートまたはN2ストックプレート)から3〜5匹の動物を、溶解ワークシートに示された適切なキャップ位置に選びます。溶解ワークシートのlysis_notesのセクションに、溶解にピックされたワームが5つ未満のSプレートのメモを記録します。 線虫をストリップチューブの各位置にロードした後、キャップストリップをストリップチューブに戻す。マークされたキャップ(位置1)とマークされたチューブ(位置1)を一致させます。蓋をしたら、線虫がチューブの底になるまでストリップチューブを短時間遠心分離します。 ストリップを-80°Cの冷凍庫に入れ、完全に凍結するまで(少なくとも10分間)置く。すべてのストリップに溶解のために線虫が追加されるまで、手順7.9〜7.11を繰り返します。チューブストリップを番号順に整理します。 ストリップチューブのセットを取り出し、サーモサイクラーで溶解プログラムを実行します:60°Cで1時間、95°Cで15分、12°Cで保持します。 溶解プログラムが完了したら、サンプルを 300 x g で RT で 15 秒間スピンダウンし、溶解液を -80 °C で最大 1 週間保存します。 96ウェルプレートホルダーを使用してチューブストリップを番号順に整理し、増殖ボックス番号、ストリップチューブ番号の範囲、日付、および研究者のイニシャルを含むラベルを含めます。遺伝子型決定シートの列「lysis_date」と「lysis_notes」を溶解ワークシートからの情報で更新します。 8. SSU および ITS2 配列の PCR 注: このセクションでは、溶解した S プレートごとに 2 つの個別の PCR を実行する方法について説明します。第1のプライマーセットは、18S rDNAスモールサブユニット遺伝子(SSU)の500-bp断片を増幅する;oECA1271 = フォワードプライマー TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = リバースプライマー CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA 12.このPCRは、鋳型DNAの品質をチェックするために使用されます。PCRは、ほぼすべての線虫種のSSU領域を増幅します。SSU PCRが増幅に失敗した場合、この結果は、溶解の質が悪く、このSプレートに対して溶解を繰り返す必要があることを示唆している。第2のプライマーセットは、5.8Sおよび28S rDNA遺伝子間の内部転写スペーサー領域の2,000-bp断片を増幅する(ITS2);oECA1687 = フォワードプライマー CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = リバースプライマー GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3.ITS2 PCR産物はサンガー配列決定されており、その配列は、配列類似性によって種レベルにカエノラブディティス属の線虫を同定するために使用される。 ジェノタイピングシートのフィルタリングツールを使用して、PCRに使用するSラベルのみを表示します。 pcr_plate_numberを更新し、ジェノタイピングシートの列をpcr_wellします。溶解材料の分解を防ぐために、SSU および ITS2 PCR が同時に実行されます。 ITS2 PCR と SSU PCR は、別々のプレートでの別々の反応であっても、同じpcr_plate_numberを使用します。それらは「SSU」または「ITS2」ラベルで区別されます。 pcr_plate_numberを8本以下のストリップチューブ(96ウェルPCRプレートの1列につき1本のストリップチューブ、昇順で配置、例えば、一番上に最も低いストリップチューブ番号)に割り当てます。次に、ストリップチューブ内の各Sラベルにpcr_plate_wellを割り当てます。メモ: ストリップチューブは昇順で配置され、最も低いストリップチューブ番号が行 A に、最も高い番号が行 H に割り当てられます。すべてのストリップチューブの位置 1 が列 1 に割り当てられます。したがって、ストリップチューブ番号1、位置1はPCRプレート番号1、ウェルA01に割り当てられることになる。 PCR に使用するサンプルを収容するために、96 ウェル PCR プレートにラベルを付けます。各PCRプレートに、プロジェクト名、PCRタイプ、PCRプレート番号、PCRの日付(2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304など)の情報をラベル付けします。また、プレートには、各行にロードされるストリップチューブ番号のラベルを付けます。 -80°Cの冷凍庫から溶解物質を取り出し、溶解物質を含むストリップチューブを氷上で解凍する。溶解材料が融解している間に、ITS2およびSSUマスターミックスを氷上の別々のチューブで調製する。SSU および ITS2 PCR レシピは、 補足表 2 に記載されています。メモ: ピペッティングエラーを許容するために、各 96 ウェルプレートに対して PCR マスターミックスを 100 反応準備します。大容量を使用する場合は、15 mL または 50 mL の円錐形を使用してマスターミックスを保持します。 Taqがミックス全体に分散するまで、マスターミックスを穏やかに渦巻きます。混合したら、マスターミックス38 μLを氷上のPCRプレートの適切なウェルにアリコートします。滅菌シングルユース v-bottom トラフと 12 ウェルマルチチャンネルピペットを使用して、マスターミックスを PCR プレートに移します。 解凍した溶解ストリップチューブをスピンダウンして、キャップから溶解材料を除去します。最初の PCR プレートにロードされるすべてのストリップチューブの蓋を慎重に取り外します。少量のマルチチャンネルピペット(12 ウェルまたは 8 ウェル)を使用して、PCR プレートの適切なウェルに 2 μL の溶解液を追加します。2μLを除去する前に、溶解液を1回上下に軽くピペットでピペットする。メモ: ヒントをチェックして、転送前に溶解が含まれていることを確認してください。行または列の間でヒントを変更することを忘れないでください。 PCR プレートを PCR 接着箔で覆い、ローラーを使用して密閉を作成します。ホイルを塗布した後、遠心分離機でPCRプレートを短時間スピンダウンします。サーモサイクラーで作動する準備ができるまで、プレートを氷の上に置きます。 適切なサーモサイクラープログラムでPCRを実行します。SSU および ITS2 PCR プログラムの詳細については、 補足表 2 を参照してください。 すべてのPCRが実行されるまで、手順8.4~8.8を繰り返します。 PCR反応が実行されている間、100 mLの1.5%アガロースゲルを注ぎます。各ゲルは、サンプルまたは単一のPCRプレートを保持する。 1.5 g のアガロースを 500 mL フラスコに加え、次いで 100 mL の 1x TAE バッファー (補足表 3) を加え、旋回して混合します。電子レンジでゲルを溶解・冷却する。 溶液が冷却されたら、5 μLの10 mg/mL臭化エチジウム溶液を加え、混合して混ぜ合わせる。ゲルが96サンプルとゲル内の各行のためのはしごを収容できるように、4つの25ウェルコームを備えたキャスティングトレイに溶液を注ぎます。注:臭化エチジウムは強力な変異原です。臭化エチジウムを取り扱う場合は、白衣、耐薬品性手袋、化学安全ゴーグルを使用してください。 PCR が終了する直前に、使い捨てトラフに 6 倍のローディング色素を追加し、マルチチャンネルピペットを使用して、新しい 96 ウェル PCR プレートの各ウェルに 2 μL の 6 倍ローディング色素を追加します。このプレートは、サンプルをゲルにロードするために使用されます。すべてのサンプルを収容するのに十分なこれらのプレートを作ります。 PCR が完了したら、PCR プレートを取り出し、RT で 300 x g で 15 秒間短時間遠心分離します。PCR 産物がゲル上で使い果たされるまで、PCR プレートを氷上に保管します。 製品をゲル上に流すには、12 ウェルのマルチチャンネルピペットを使用して、2 μL の 6x ローディング色素を含む 96 ウェルプレートの適切なウェルに各サンプルを 5 μL 加えます。 次いで、この混合物の6μLを最近鋳造されたゲルの各ウェルにロードする。6 μL の 1 KB プラスラダーをゲルの各列の最初のウェルにロードします。注: ゲルのウェルを充填するには、ゲルの最初の行の PCR プレートから行 A と行 B を散在させる必要がある場合があります。混乱を避けるために、各PCRサンプルのgel_numberとgel_positionをジェノタイピングシートに記録します。 プレート内の残りのPCRに新しいホイル蓋を置き、4°Cで保存します。 これらの反応生成物は、ステップ9における配列決定に使用されるであろう。 PCR 産物をゲル上で 120 V で 20 分間実行します。ゲルを画像化し、どのSラベルがITS2および/またはSSU PCR産物をジェノタイピングシートの「pcr_product_its2」および「prc_product_ssu」列に記録するかを記録する。バンドの存在を「1」でマークする。バンドなしの場合は ‘0’ をマークします。 9. サンガーシーケンシングとシークエンスBLASTによる線虫の同定 注:このセクションでは、SラベルからITS2アンプリコンを配列決定し、BLASTアルゴリズムを使用してこれらの配列を国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)データベースにアライメントし、BLAST結果を解析してSプレート上の線虫を同定する手順を提供します。 ITS2陽性である各サンプルについて、フォワードプライマーoECA306(CACTTTCAAGCAACCCGAC)を用いたサンガーシークエンシングのために残りのITS2 PCR産物を使用する。各Sラベルの「sequencing_plate」列と「sequencing_well」列をジェノタイピングシートに記録することで、シーケンシング出力ファイルをSラベルに簡単にリンクできるように手配します。 各 S ラベルの .seq 出力ファイルをシーケンス プラットフォームから取得します。プロジェクトの .seq ファイルを 1 つのディレクトリに配置し、サブディレクトリにあるシーケンスの各バッチの .seq ファイルを配置します。 コマンド行インターフェース・ツールを開き、コマンド cd を入力して、.seq ファイルが入っている最上位ディレクトリーに移動します。まだ存在しない場合は、次のコマンドを入力して、すべての .seq ファイルに対してマージされた FASTA を作成します。* / のディレクトリに対して、cd $dirを実行する、*.seq 内のファイルに対して、”>” をエコーする$file; cat $file;done >>../all_seqs.fa;cd ..;完了しました。注: このコードは、プロジェクト ディレクトリ内のすべての .seq ファイルから ‘all_seqs.fa’ という名前のマージされた FASTA ファイルを作成します。このファイルは、NCBIオンラインヌクレオチドBLASTツールで使用して、各S標識のITS2配列をNCBIの配列データベースに迅速にアラインメントすることができます。 ウェブブラウザで、NBCI BLASTウェブサイト20に移動し、[ ファイルを選択] ボタンをクリックします。作成したばかりのall_seqs.faファイルを選択し、 やや類似したシーケンス(BLASTn)ボタンをクリックします。ページの下部にある BLASTボタンをクリックして、 BLAST検索を開始します。 各SラベルのBLAST結果でジェノタイピングシートを更新します。フィルターツールを使用して、ジェノタイピングGoogleシートの更新を容易にします。[ データ] > [フィルターの作成] をクリックして、各列ヘッダーにフィルター ボタンを追加します。sequencing_plate列をフィルタリングして、BLAST結果で更新するシーケンシングプレートを選択します。 NCBI BLAST結果ページのドロップダウンメニューを使用して、各SプレートITS2シーケンスの結果を確認します(図6)。 BLASTがヒットしていないかどうかを確認します。*という接頭辞が付いたドロップダウンのシーケンスIDには、爆発ヒットはありません。これらの S ラベルについては、ジェノタイピング シートの現在の日付manual_blast_notes」と入力します。 新しいカエノラブディティスの可能性のある種を確認してください。一番上のヒットのリンクをクリックして、アライメントを視覚化します(図6)。トップヒットが(1)カエノラブディティス種であり、(2)アラインメントが配列の中心に5つ以上のミスマッチを含み、(3)クエリカバレッジが50%を超える場合、この結果は、分離株が新しいカエノハブディティス種である可能性があることを示唆している(図7)。これらのSプレートが入ると、一番上のBLASTの種が「species_id」列にヒットし、「possible_new_caeno_sp列」に1を入力し、「可能な新しいCaeno sp.」を「manual_blast_notes」列に「可能な新しいCaeno sp.」と同一性の割合とともに入力します(例:「可能な新しいCaeno sp. 89%の同一性」)。 Caenorhabditis種にBLASTするSプレート配列の場合、「species_id」列にBLASTがヒットした上位の属名と種名を入力します。たとえば、「Caenorhabditis elegans」などです。 非カエノラブディティス種にBLASTするSプレート配列の場合、「species_id」列にBLASTヒットの上位の属のみを入力し、その後に「sp.」と入力します。この表記は、分離株が命名された属内の未知の種であることを意味する。たとえば、’Oscheius sp.’ などです。注:ITS2配列は、Caenorhabditis属の外側の種レベルまでの分離株を確実に同定するために使用することはできません3,13。 ‘make_strain_name’ = ‘Caenorhabditis elegans’、’Caenorhabditis briggsae’、または ‘Caenorhabditis tropicalis’、または ‘species_id’ = 1 の場合、ジェノタイピングシートの ‘possible_new_caeno_sp列’ に 1 を入力します。 Caenorhabditisの命名規則に従って、株に一意の名前を付ける、すなわち、2〜3個の大文字とそれに続く各固有の株の数字からなる一意の実験室指定23。「strain_name」列にひずみ名を入力します。 株に名前を付けた後、確立されたプロトコル 24を使用して凍結保存することができます。 10. R の easyFulcrum パッケージでコレクション データを処理する 注: この手順では、easyFulcrum R パッケージを使用して、コレクション データ (C ラベル) と線虫分離データ (S ラベル) をリンクする方法について説明します。このソフトウェアには、Fulcrum データをジェノタイピングシートのジェノタイピングデータとさらに結合する機能が含まれているため、S ラベル種のアイデンティティと株名が 1 つのデータ フレームに編成されます。 コレクションプロジェクトの名前の新しいディレクトリを作成します。ディレクトリ内のフォルダー構造は、R パッケージ easyFulcrum15 で説明されている要件に合わせて配置します。 フルクラム Web サイトに移動し、サインインします。左側の Fulcrum Web サイトのデータエクスポートツールを使用して、フルクラムデータベースから生のプロジェクトデータをエクスポートし、プロジェクト、写真を含める、GPS データを含める、フィールドサンプリング、および分離のチェックボックスをオンにします。注: プロジェクトの支点データは、5 つのコンマ区切り値 (.csv) ファイルとしてエクスポートされます。完全なプロジェクトデータは、RのeasyFulcrumパッケージを使用して単一のデータフレームに結合されます。 Fulcrum からエクスポートされた 5 つの.csvファイルを、easyFulcrum ビネット 21 の指示に従って、手順 10.1 で作成したプロジェクトディレクトリに移動します。 Rstudio セッションを開き、R コンソール ‘install.packages(“devtools”)’ と ‘devtools::install_github(“AndersenLab/easyfulcrum”)’ で次のコマンドを入力して、Rに easyfulcrum パッケージをインストールします。 新しい R スクリプトを開き、イージーフルクラム ビネットの指示に従ってコレクション データを処理します21。