Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

Hücre kültürü teknikleri, sağlık ve hastalıkta hücresel nörofizyolojinin çeşitli alanlarında sayısız ilerlemeye yol açmıştır. Özellikle, bir laboratuar hayvanının nöronal dokusundan yeni izole edilmiş birincil hücre kültürleri, deneycinin farklı biyokimyasal ortamlardaki ve fizyolojik kurulumlardaki çeşitli hücrelerin davranışlarını yakından incelemesine izin verir. Hızlandırılmış video mikroskobu ile birlikte Ca^{2 +} duyarlı boyalar gibi farklı floresan fizyolojik göstergelerin kullanılması, hücresel biyofiziksel ve biyokimyasal süreçler hakkında gerçek zamanlı olarak daha iyi bir fikir verir.

ALS, üst ve alt motor nöronları etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır¹. Hastalık ailesel tipte kompleks bir patogeneze sahiptir, ancak çoğunlukla sporadik formdadır (vakaların %90’ı)². Hücre dışı otonom mekanizmaların, öncelikle glial hücrelerin temel rolü nedeniyle ALS patofizyolojisine katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir³. ALS ayrıca inflamasyonun humoral ve hücresel faktörlerinin tutulumu olan nöroinflamatuar bir hastalık olarak da karakterizedir.

İmmünoglobulin G, ALS ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda moleküler bir belirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu belirtecin serum seviyesinin incelenmesi, hastalıkta nöroinflamasyonun varlığını ve evresini^{gösterebilir 4,5,6}, beyin omurilik sıvısındaki varlığı ise kan beyin bariyerinin ihlalini gösterebilir ⁷. IgG’ler ayrıca ALS hastalarının omurilik motor nöronlarında birikintiler olarak tanımlandı⁷. Bununla birlikte, bu yaklaşım IgG düzeyinin hastalığın evresi ve özellikleri ile korelasyonunda bazı tutarsızlıklar göstermiştir⁶.

ALS hastalarının serumlarından izole edilen IgG (ALS IgG), naif astrositlerde⁸ ve nöronlarda glutamat salınımında kalsiyum yanıtı indükleyebilir ve bu da ALS patolojisi^9’un bir işareti olan eksitotoksik bir etkiye işaret eder. Bununla birlikte, hSOD1^G93A ALS sıçan modeli üzerine yapılan çalışmalar (insan SOD1 mutasyonu^10’un birden fazla kopyasını içeren), kültürlenmiş nöroglial hücrelerde¹¹, dokularda ^12,13,14 veya canlı hayvanlarda oksidatif stresin bir dizi belirtecini göstermiştir ¹³. ALS sıçan modelinden kültürlenen astrositlerin, peroksit tarafından indüklenen oksidatif strese, transgenik olmayan çöp arkadaşlarından gelen astrogliadan daha yatkın olmaları dikkat çekicidir¹¹.

Kültürdeki mikroglial hücreler ALS IgG’den daha az belirgin bir şekilde etkilenir. Yani, bir BV-2 mikroglial hücre hattı, sadece 4/11 ALS IgG hasta örneklerinin uygulanmasına yanıt olarak oksidatif stresin floresan belirteçlerinden gelen sinyalde bir artış gösterdi¹⁵. Mikroglia’nın birçok nöroinflamatuar patolojiye katıldığı, ALS^16,17’nin hücre dışı otonom mekanizmasında oksidatif strese ve geç progresyon fazına katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, ALS IgGs ile ilgili veriler, bu hücrelerin ALS iltihabının bu humoral faktörlerine astrositler kadar reaktif olmayabileceğini göstermiştir. ALS murin modellerinden primer astrositlerle, sadece yavrularda değil, aynı zamanda semptomatik hayvanlarda, beyinde veya omurilikte 18,19,20,21 üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bu aynı zamanda mikroglial primer kültürler için de geçerlidir, ancak astrositlerden daha az ölçüde ve çoğunlukla embriyonik aşamadaki beyin bölgelerinden^22,23,24.

Kültürdeki hücreler üzerinde Ca^{2 +} ‘nın hızlandırılmış video görüntülemesini, öncelikle eksitotoksisitenin fizyolojik bir belirteci olarak bu iyonun hücre içi geçicilerini takip etmenin bir aracı olarak kullanıyoruz. Böylece, bu geçicilerin biyofiziksel karakterizasyonu ile (genlik, geçici altındaki alan, yükselme zamanı, frekans) araştırmacı, nörodejenerasyonun çeşitli hücresel modellerinden deneysel tanı parametreleri elde edebilir. Bu nedenle bu teknik, IgG’lerin hastalık biyobelirteçleri olarak kantitatif fizyolojik değerlendirmesinin bir avantajını sunar. ALS indüksiyonunda IgGs ve Ca²⁺‘nın rolü hakkında geniş bir literatür bulunmaktadır. Bu çalışmaların çoğu, hasta IgG’leri deney hayvanlarına 25,26,27,28,29 enjekte ederek ALS’yi indükleyerek gerçekleştirildi ve daha sonra hücre içi Ca ²⁺ yükselmesi ve IgG birikintileri görüldü. Bir dizi çalışma, ALS IgG’lerin in vitro^30,31,32 motor sinaps üzerindeki etkisini araştırdı. Yukarıdaki bağlamda, burada sunulan teknik, ALS’nin hücre dışı otonom mekanizmasında önemli oyuncular olarak glial hücrelere odaklanmakta ve nöroinflamasyonun humoral faktörleri olarak IgG’lere potansiyel eksitotoksik yanıtlarını ölçmektedir. Bu yaklaşım, farklı hücre kültürü sistemlerinde ve genel inflamasyonun hücresel modellerinde bütün serumlar, BOS veya sitokinler gibi diğer humoral faktörlerin test edilmesinde daha geniş bir uygulamaya sahip olabilir.

Bu yazıda, Sprague Dawley sıçanlarının kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların birincil kültürlerinin nasıl hazırlanacağı ve bu hücrelerin hasta sera kaynaklı IgG ile ALS patofizyolojisini incelemek için nasıl daha fazla kullanılacağı açıklanmaktadır. Protokoller, kültürlenmiş hücrelerin boya yüklenmesi (Şekil 1) ve hızlandırılmış video görüntüleme deneylerinde Ca²⁺ değişikliklerinin kayıtları için detaylandırılmıştır. Video kayıtlarının örnekleri, glial hücrelerin ALS IgG’ye ATP’ye kıyasla nasıl tepki verdiğini gösterecektir, ikincisi pürinerjik membran reseptörlerini aktive eder. İlk kez gösterilen, hSOD1^G93A ALS sıçan beyninden izole edilen astrositlerin, transgenik olmayan kontrollere kıyasla ALS IgG’ye daha belirgin bir Ca²⁺ yanıtı ile nasıl tepki verdiğine ve bu sürecin Ca^{2 +} depo operasyonundaki farklılıklarla nasıl ilişkilendirileceğine dair bir örnektir. Ayrıca, ALS IgG ile akut olarak meydan okuyan mikroglial hücrelerde, hücre içi kalsiyumun sadece mütevazı bir cevabı ile kalsiyum görüntülemenin bir örneği gösterilmiştir.